本文选自autophage，https://doi.org/10.1080/15548627.2019.1635383，喜欢的朋友可以自行下载阅读。
损害巨自噬/自噬与肝纤维化的发病机制有关。但是，阻断自噬如何促进纤维化尚不清楚。在这里，我们旨在为应激蛋白TRIB3（triggs pseudokinase 3）介导的自噬功能障碍定义一种先前尚未揭示的促纤维化机制。人肝纤维化组织取自进行了开放式手术修复的肝硬化患者。在由胆管结扎（BDL）或硫代乙酰胺（TAA）注射诱导的肝纤维化小鼠模型中评估了TRIB3的功能含义。与非纤维化组织相比，人纤维化肝组织表达的TRIB3和选择性自噬受体SQSTM1/p62（螯合物1）水平更高，并且在纤维化组织中TRIB3和SQSTM1的表达升高呈正相关。沉默Trib3可以防止实验性肝纤维化，并在纤维化肝组织中恢复自噬活性。此外，TRIB3与SQSTM1相互作用并阻碍其与MAP1LC3/ LC3的结合，这导致SQSTM1聚集体的积累并阻碍了自噬通量。 TRIB3介导的自噬损伤不仅抑制了晚期内体的自噬降解，而且还促进了富含INHBA /Activin A的外泌体的肝细胞分泌，从而引起肝星状细胞（HSCs）（肝纤维化的效应细胞）的迁移，增殖和活化。通过恢复肝细胞和HSCs中的自噬通量，破坏与特定螺旋肽的TRIB3-SQSTM1相互作用产生了针对肝纤维化的有效保护作用。压力升高的TRIB3表达共同通过与SQSTM1相互作用并干扰其在肝实质细胞中的功能并激活HSC来促进肝纤维化。靶向这种相互作用是治疗纤维增生性肝病的一种有前途的策略。
首先作者从临床样本入手，观察TRIB3在肝硬化的表达以及与自噬的关系。发现TRIB3和p62呈正相关，并且LC3水平也升高，并且TRIB3主要与肝细胞共定位，这里结合以前所知道的知识，自噬有早期自噬和晚期自噬之分，还有个货车P62,p62负责把底物转运到自噬体的作用，当早期自噬启动也就是ATG复合物形成，晚期自噬的标志是自噬体和LC3II增多，有些人把LC3II/I作为晚期自噬的标志，P62降低也与自噬相关。BECN1也是自噬的标志蛋白。
作者然后在动物实验上进一步验证了TRIB3在诱导肝纤维化的鼠的作用。应用了特异性敲除的鼠，发现肝细胞敲除TRIB3后，抑制了肝纤维化进程。以此得出TRIB3通过抑制纤维化肝组织的自噬促进肝硬化
接着作者就探讨TRIB3/P62和自噬的关系。发现在饥饿后的细胞TRIB3/p62表达增多，通过CO-IP可以用p62拉下TRIB3和LC3，并且过表达TRIB3后可以抑制p62与LC3的结合。并且发现过表达TRIB3后自噬体和MVB增多了，用LBPA量化了MVB的分布，发现增强表达TRIB3后核周围明显聚集。然后，作者进一步确定了一下自噬体是不是与溶酶体融合发挥自噬作用，共定位发现TRIB3与LAMP1共位减少。表明TRIB3的高表达抑制了晚期内体与溶酶体的融合。
结合上面的实验结果，既然自噬功能异常，MVB增多，MVB是外泌体的前体，那么是不是TRIB3促进了外泌体释放呢。这里引入了外泌体的蛋白TSG101，ECART-1的亚基，免疫荧光染色显示在饥饿24小时后，TSG101与SQSTM1在TRIB3过表达的肝细胞中共定位，但是另外一个ECART的亚基HGS,SNF8，CHMP3并没有改变。放线菌酮明显促进了TRIB3敲除细胞的TSG101/P62降解，并被自噬抑制剂挽救。表明TRIB3抑制了P62介导的TSG101的降解。接着作者看外泌体了，发现TRIB3过表达促进了肝细胞外泌体释放，并且抑制TSG101可以抑制这个作用。
那么接下来就是看看外泌体如何影响HSC的了。发现过表达TRIB3的肝细胞提取的外泌体可以促进HSC活化，并且为了排除其他的影响，作者用了去外泌体上清作了与HSC相关的实验，并没有发现HSC活化表现，然后，作了外泌体摄取实验，紧接着找外泌体中的东西，发现了一个高表达蛋白，并且敲除这个蛋白进一步验证了活化HSC的作用。
总的来说，文章也算完整了，既然TRIB3通过结合P62发挥抑制自噬的作用，那么，抑制他们的结合，会不会逆转这个功能呢？作者引入了一个pep-A2这个东西，可以抑制两者结合，在细胞水平作了上述实验，发现原来的过程都被逆转了。
再来波动物，无他，就是将上面的动物实验，在加一组而已，发现这个过程也逆转了，总体来说体内、体外验证都完成了。
好了，文章分享结束，总体来说，文章逻辑性还是非常严谨的，如果做自噬可以看看，文章中有用到肝和HSC原代细胞，欢迎批评、指正。
鼠肝原代和HSC原代细胞提取：从正常或纤维化肝脏中分离出包括肝细胞和HSC在内的原代肝细胞。在37°C下用EGTA溶液原位灌注小鼠肝脏，然后在37°C的条件下灌注链霉蛋白酶（Sigma，P5147）溶液和胶原酶D（Roche，11088882001）溶液以分离原代肝细胞。灌注后，将肝脏转移到含有蛋白酶和胶原酶D溶液的无菌培养皿中。轻轻切碎后，将肝脏和细胞悬液通过70μm细胞过滤器过滤，并在4°C下以300 g离心3分钟以分离出肝细胞。将上清液转移至新管中，并在4°C下以1000 g离心10分钟。吸出上清液，直到管中剩余15 ml，然后添加50μL DNaseI（Roche，10104159001）以降低细胞悬液的粘度，并用50 ml GBSS /B洗涤一次。将细胞沉淀重悬于12％Nycodenz（AXIS-SHIELD，1002424）溶液中，并在1700g（无制动）下于4°C离心15分钟以分离HSC。在添加了10％胎牛血清（FBS），胰岛素（Sigma，I9278），地塞米松（Sigma，D4902）和青霉素-链霉素（Gibco，15070063）的DMEM培养基（Gibco，10564029）中培养原代肝细胞（Corning，354236）。将HSCs在补充有10％FBS和青霉素-链霉素的RPMI-1640培养基（Gibco，72400120）中培养。
