流程
实验流程
用TRIzol，对总样品的RNA进行分离和纯化。然后用NanoDrop ND-1000对总RNA的量与纯度进行质控。再通过Bioanalyzer 2100对RNA的完整性进行检测，同时通过琼脂糖电泳的方案进行验证。浓度>50ng/μL，RIN值>7.0，OD260/280>1.8，total RNA>1μg满足下游实验。加入镁离子打断试剂盒在94℃高温条件下对total RNA进行片段化处理5min。使用免疫磁珠与m6A抗体预混，将预混好的m6A-免疫磁珠与片段化的RNA（含有核糖体RNA片段）进行IP，从而得到IP产物。IP产物在逆转录酶的催化下合成一链cDNA，后加入接头进行第一轮PCR--预变性94℃ 1min，98℃ 变性15s，55℃退火15s,68℃延伸30s,最后再保持68℃延伸2min，共5个循环，合成二链DNA。使用纯化珠将扩增的DNA文库进行纯化。将R-Probes v2探针和ZapR v2 酶加入到DNA文库从而达到去除核糖体RNA反转录的cDNA序列的目的--72℃ 孵育2min，4℃保持2min，37℃ 1h,72℃ 10min，最后4℃保持。通过第二轮PCR对最终文库进行扩增，PCR程序设置与第一轮一致，循环数增加至12-16个。最后，我们使用illumina Novaseq™ 6000 按照标准操作对其进行双端测序，测序模式为PE150。
生物信息分析流程
下机原始数据格式为fastq，我们首先使用fastp（https://github.com/OpenGene/fastp）的默认参数对所有IP样本和Input样本下机原始数据进行质控，包括去除接头、重复序列和低质量序列，得到CleanData用于后续分析。然后使用HISAT2（http://daehwankimlab.github.io/hisat2）将CleanData比对到基因组上（拉丁文：Mus musculus, 基因组版本：v101），再利用得到的bam文件使用R包exomePeak2（https://bioconductor.org/packages/release/bioc/html/exomePeak2.html）进行Peak calling和diff Peak分析，并使用ANNOVAR（ http://www.openbioinformatics.org/annovar/）对peak进行注释。最后使用MEME2（http://meme-suite.org）和HOMER（http://homer.ucsd.edu/homer/motif）进行motif分析。基因组装和定量软件为StringTie（https://ccb.jhu.edu/software/stringtie），定量方式为FPKM（total exon fragments/mapped reads (millions)× exon length (kB)），并使用R包edgeR（https://bioconductor.org/packages/edgeR）进行差异分析，差异倍数FC（fold change）≥2或FC≤0.5且p值小于0.05。
MeRIP测序生信分析流程图
Reference:
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2020年陈建军教授在Cancer Cell上发表的关于mRNA和non-coding RNA上m6A修饰的综述值得一读，联川进行了全文翻译：https://mp.weixin.qq.com/s/9lhlRAs425ePfclhfbvLqQ
