起因是在阅读一篇文献时发现了这么一段话： In the initial step,we spiked 2 × 106 mRNA-GFP and 2 × 106 mRNA-RFP, transcribed in vitro, into each lysed sample for RNA isolation.
关于什么是spike-in，可以先移步从spike-in到DESeq2：文库normalization这篇。
概括一下就是在建库前往不同样本的total RNA中掺入已知序列的定量外源mRNA，然后通过比较它们的reads数，能比较不同样本间mRNA的总量，对基因表达数据进行绝对值的矫正。
目前使用最多的spike-in是ERCC( The External RNA Control Consortium)的spike-in MIX，有mix1和mix2两只试剂，混合有92种不同的mRNA。ERCC的试剂盒售价高达2万元，若非必要一般也不会去买。这篇文献的作者没有使用ERCC，所以就简单的拿GFP和RFP来当spike in。
首先，我从EBI上下载了原文献的原始数据，然后质量过滤，得到clean fastq。由于文中未提到具体的GFP和RFP序列，我便在SnapGene里挑了常用的GFP，EGFP,mChery，DsRed1试试能不能map出来。
我用的软件是HISAT2，首先要建立index。有两种选择，一是将四个荧光蛋白序列加入到小鼠基因组的fasta文件里，这样可以一次性全读出来；二是就用这四条序列建个index。我选择了第二种，将四条序列加到一个fasta文件中，大致就是下图这样。
然后就hisat2 build ，index建好后就比对，具体指令可以看相应的文章。
比对得到的sam文件用samtools 转换为bam格式，然后以位置排序。我使用的计reads数的软件是stringtie，用其他计数软件也没问题。
重点是用来计数的annotation文件该怎么处理？
GFP havana exon 1 717 . + . gene_id "GFP"; transcript_id "GFP"; gene_name "GFP";
EGFP havana exon 1 720 . + . gene_id "EGFP"; transcript_id "EGFP"; gene_name "EGFP";
mCherry havana exon 1 711 . + . gene_id "mCherry"; transcript_id "mCherry"; gene_name "mCherry";
DsRed1 havana exon 1 681 . + . gene_id "DsRed1"; transcript_id "DsRed1"; gene_name "DsRed1";
创建一个gtf文件，将上面的信息复制进去就好了，注意windows和linux编码的区别。
计数结果如上，可见作者是使用EGFP和mCherry作为spike in，DsRed1和mCherry有部分序列接近，所以也显示有少量reads。
文献链接：BTG4 is a meiotic cell cycle–coupled maternal-zygotic-transition licensing factor in oocytes
