Transcription factor bHLH121 regulates root cortical aerenchyma
formation in maize
实验材料：利用解剖学管道对来自威斯康辛州多样性面板的436个大田玉米自交系的RCA形成进行了表型分析（图1）。我们观察到RCA形成的显著变化，其值从总皮质横截面积的0到41%。RCA的形成具有相对的遗传性（H2 = 0.59）。我们的GWAS鉴定了Zm00001d006065（LOC100383077，位于2号染色体197129772）的两个显著单核苷酸多态性（SNPs）（SNP_191380766和SNP_191380613）
GWAS：外形观察到RCA形成的显著变化，其值从总皮质横截面积的0到41%。RCA的形成具有相对的遗传性（H2 = 0.59）。我们的GWAS鉴定了位于Zm00001基因模型Zm00001d006065（LOC100383077，位于2号染色体197129772位置）的两个显著的5‘UTR（非翻译区）（图1）。已知5‘UTR区域具有多种调控元件（转录因子（TF）结合位点、顺式调控元件和反式调控因子，如rna结合蛋白），并在翻译起始的控制中发挥重要作用。我们检查了在GWAS识别的SNP位点上是否存在任何TF结合位点，以及多态性是否改变/突变了这些位点。在5‘参考序列中，有5个感兴趣的tf结合位点。3个是乙烯反应因子，由3个独立的三个乙烯反应因子结合。
GWAS后续：我们研究了这些snp，以研究它们是否可以对它们对蛋白质结构和功能的影响提供一些见解。Zm00001d006065编码一个基本的螺旋-环-螺旋（bHLH）转录因子121（图2A）。利用瑞士模型进行蛋白质结构域分析，预测第一个螺旋结构从氨基酸158到188弯曲到氨基酸189到197的环结构，然后第二个螺旋结构从氨基酸198到236，
现象：首先在玉米基因型W22中发现了一个包含ZmbHLH121（ZmbHLH121-Mu）基因第6外显子的统一Mu转座子标记突变系（图2A）。获得了mu1021839插入的纯合突变子，插入位置为转录起始位点下游1305bp。
目的：为了确认ZmBHLH121内的突变与mu转座子系中观察到的表型有关，我们使用CRISPR/Cas9编辑方法（以下简称ZmbHLH121-CRISPR）在玉米基因型FBLL MAB遗传背景中生成了额外的突变体。获得了7个携带CRISPR/Cas9基因的独立转基因植株。一个ZmbHLH121-CRISPR突变体在第3外显子的第二个gRNA靶位点有一个5-bp的cas9诱导的缺失。
实验：与野生型背景相比，该突变体中bHLH121的转录水平没有显著差异。然而，5-bp的缺失导致了一个移码，导致了一个过早的终止密码子的形成。突变等位基因翻译的氨基酸序列在氨基酸177后与野生型序列不同；因此缺乏部分预测的DNabindg基序和所有的蛋白-蛋白相互作用基序。与野生型FBLL MAB背景相比，温室中纯合子ZmbHLH121-CRISPR突变体的根系RCA表型显著降低（图4）。
aim: 看是否和预期的表型相近
result：与预期的一样，与野生型植物相比，在control条件下生长的ZmbHLH121-CRISPR显著减少了RCA的形成，ZmbHLH121-CRISPR株系的RCA形成率为14%，而FBLL MAB野生型的RCA形成率为46%。在低氮条件下，ZmbHLH121- CRISPR突变体的RCA形成为43%，而野生型突变体的RCA为12%（图4）。在水分亏缺条件下，ZmbHLH121-CRISPR的RCA形成率为20%，而野生型的RCA形成率为48%（图4）。我们从功能丧失和过表达的研究中得出结论，即使在研究的环境应激条件下，bHLH121蛋白也可以作为RCA形成的正调控因子。这两个株系的RCA形成仅在节点3根中发生改变（但在节点2和节点4中没有改变），这与GWAS模型中使用的表型数据一致。
进行大田实验
目的：证实ZmbHLH121在田间环境胁迫下调控RCA的形成
实验：在4个不同的田间条件（高氮、低氮、高氮、两种非胁迫环境）下的ZmbHLH121突变系进行了表型分析。与岩泉和汉考克油田相比，ZmbHLH121-Mu在control条件下和氮胁迫下的RCA形成显著减少（图3）。同样，ZmbHLH121-Mu和W22之间的RCA形成在许多其他现场站点和应力条件下也可以观察到差异。在许多这些环境中，纯合子ZmbHLH121-Mu突变体的根节点3的RCA低于W22植株，而在这些环境中，根节点2和根节点4的RCA没有显著差异。说明ZmbHLH121可能参与了RCA形成的节点特异性调控。
