1、第一代测序技术
概述:用的是1975年由Sanger和Coulson开创的链终止法或者是1976-1977年由Maxam和Gilbert发明的化学法(链降解)。
发展:除了Sanger测序技术,还出现了如连接酶测序和焦磷酸法测序,其中,连接酶测序是ABI公司SOLiD技术的测序基础,焦磷酸测序是Roche公司454技术的测序基础。这两者的核心思想都利用了Sanger测序技术可中断DNA合成反应的dNTP。
特点:
(1)平均测序长度大约为250个碱基,准确率较高;
(2)可直接测未克隆的DNA片段,不需要酶催化反应;
(3)适合测定含有5-甲基腺嘌呤,G+C含量较高的特殊DNA片段以及短链核苷酸的序列。
缺点:测序成本高,通量低,速度慢。
2、第二代测序技术
概述:有Roche公司的454技术、Illumina公司的Solexa/HiSeq技术和ABI公司的SOLiD技术。目前,Illumina的测序仪占全球75%以上的市场份额,以HiSeq系列为主。Illumina的及其采用的都是边合成边测序的方法。
步骤;
(1)构建DNA测序文库-超声打断加接头 (2)测序流动槽-吸附流动DNA片段 (3)桥式PCR扩增与变性-放大信号 (4)测序-测序碱基转化为光学信号
特点:
(1)测序速度较第一代,测序成本较第一代低,并且保持了高准确度;
(2)测序读段较短,比第一代测序技术的读段要短很多,大多只有100bp~150bp;
3、第三代测序技术
概述:以PacBio公司的SMRT和Oxford Nanopore公司的纳米孔单分子测序技术为标志。
特点:
(1)与前两代相比,第三代测序技术是单分子测序;
(2)测序过程无须进行PCR扩增
(3)具有超长读段,平均可达到10kbp ~ 15kbp,测序过程中这些序列的读段长度是不相等的。