文献概要
标题: Enhanced Delivery of CRISPR/Cas9 System Based on Biomimetic Nanoparticles for Hepatitis B Virus Therapy
期刊: Journal of Controlled Release
影响因子: 11.467年
研究内容
该研究开发了一种基于Gemini表面活性剂（GS）的非病毒基因递送系统，用于递送CRISPR/Cas9系统以治疗乙型肝炎病毒（HBV）感染。通过修饰红细胞膜（RBCM）或肝细胞膜（HCM），构建了具有靶向性和生物相容性的纳米颗粒（GS-pDNA@Cas9-CMs）。实验表明，该系统在体外和体内均能高效递送CRISPR/Cas9，显著降低HBV的共价闭合环状DNA（cccDNA）和其他病毒标志物的水平。
实验过程（采用英格恩产品）
质粒构建与转染
使用英格恩（Engreen Biosystem）的Entranster™ in vivo作为商业化转染试剂（阳性对照），通过尾静脉注射将CRISPR/Cas9质粒递送至小鼠体内。
在体外实验中，使用Lipofectamine™ 2000（Invitrogen）作为阳性对照，比较GS基纳米颗粒的转染效率。
动物模型建立
采用高压水动力注射法（hydrodynamic injection）将HBV cccDNA导入CBA/CaJ小鼠，建立HBV感染模型。通过ELISA检测血清中的HBeAg和HBsAg，验证模型成功。
纳米颗粒制备与表征
GS与质粒DNA（pDNA）通过自组装形成复合物（GS-pDNA），并通过RBCM或HCM修饰形成仿生纳米颗粒（GS-pDNA@Cas9-CMs）。
使用动态光散射（DLS）和透射电镜（TEM）分析纳米颗粒的粒径、电位和形态。
体外和体内转染效率评估
在AML-12、LX-2和HepG2.2.15细胞中，通过荧光素酶报告基因（pGL3-Luc）和流式细胞术评估转染效率。
在小鼠模型中，通过活体成像（IVIS Lumina系统）和器官荧光定量分析纳米颗粒的肝脏靶向性。
HBV抑制效果检测
通过qPCR检测HBV DNA和cccDNA的拷贝数，ELISA检测HBeAg和HBsAg水平，验证CRISPR/Cas9系统对HBV复制的抑制作用。
使用NGS（下一代测序）验证脱靶效应，确保治疗的安全性。
安全性评估
通过溶血实验、CCK-8细胞毒性实验和血清生化指标（ALT、AST、CREA等）评估纳米颗粒的生物相容性。
组织切片（H&E染色）观察肝脏和肾脏的病理变化。
实验意义
解决HBV治疗难题
当前临床药物（如干扰素和核苷类似物）无法彻底清除cccDNA，而本研究通过CRISPR/Cas9系统直接靶向切割cccDNA，为根治HBV提供了新策略。
创新递送系统
基于GS的仿生纳米颗粒兼具高效转染和低免疫原性，克服了病毒载体和传统非病毒载体的局限性（如高毒性、复杂制备工艺）。
HCM修饰的纳米颗粒表现出同源靶向性，显著提高了肝脏递送效率。
临床转化潜力
体外实验中，GS-pDNA@Cas9-HCM对cccDNA的抑制率达96.47%；体内实验显示cccDNA减少52.34%，且安全性良好。
研究为CRISPR/Cas9在慢性HBV感染治疗中的应用提供了实验基础，推动了基因编辑疗法的临床进展。
机制研究
阐明了纳米颗粒的内吞途径（如网格蛋白依赖或小窝蛋白依赖途径），为优化递送系统提供了理论依据。
总之，该研究为HBV的基因治疗提供了一种高效、安全的递送平台，具有重要的科学价值和临床应用前景。
