在进行核酸原位杂交以及蛋白免疫组化实验流程中，有一个很关键但有时不被重视的步骤，那就是样品前处理过程，包括待测样品的固定、包埋和切片。前处理过程正确与规范的操作有助于更好地保持组织结构和分子完整性、保存生物分子空间位置以及获得高质量实验结果，进而在生物医学研究、组织学分析和病理学诊断中提供更加准确、清晰的实验结果。
小编在此为大家整理了一份样品固定与包埋宝典，尤其针对RNA原位杂交流程。从固定剂选择，到不同的包埋方式，为大家提供一份参考，为珍贵样品和宝贵的实验时间提供一点小小帮助。
一、固定剂选择：
与蛋白质和DNA相比，RNA更不稳定，因此在进行RNA原位杂交实验时，固定剂种类、浓度和固定时间的选择十分重要。RNA原位杂交中固定剂最常用的是多聚甲醛，和其它固定剂（如酒精/醋酸混合液、戊二醛）相比，多聚甲醛能较好地保存RNA和组织形态结构，且不会与蛋白质产生过度广泛的交叉连接，因而不会影响探针穿透入细胞或组织。
此外，为了最大限度地保持RNA完整性，一方面可以使用DEPC处理后的4% PFA进行固定（目前已经有商业化4% PFA,RNase free，使用起来更加方便）；另一方面，实验材料在取材后应尽快及时地进行固定或冷冻处理，以最大程度减少取材到固定过程中的RNA降解。
二、包埋方式：
常见包埋方法有液氮冷冻包埋、固定后冰冻包埋、石蜡包埋等，每种包埋方法都有其特定的应用场景和限制，实验者需要根据实验具体要求和条件来选择最合适的包埋方法。
1）液氮冷冻包埋：采取新鲜组织后，立即放入液氮中，后用OCT包埋切片。此方法操作简单，用时少，但液氮容易在组织周围产生空泡，使组织冷却不均匀，导致组织形态被人为改变。且由于没有进行化学固定，组织中的某些易变化成分可能会在切片过程中发生扩散，影响实验结果的准确性，一般采取这种处理方式会比较少，需要新鲜取材组织立马开展后续原位杂交检测实验，不利于组织RNA的保存。
2）固定后冰冻包埋：能较好保存组织中的靶标分子，处理步骤较为简洁，但形态保留较差，不易做连续切片。一般可以进行灌流（很好的去除组织自身背景）的材料优先选择这种包埋方式，且包埋剂OCT用pbs即可轻松去除，对后续实验影响较小。但实验材料需要-80℃低温保存条件来延缓RNA降解速度，例如小鼠脑等。
冰冻组织固定脱水包埋流程:
固定：一般4℃固定24h即可，时间因组织而异，一般不超过48 h，固定不足会导致信号丢失；固定过长，组织背景干扰增强，探针不容易结合。
脱水：30%蔗糖以1×DEPC-PBS配制(先溶解再定容)，体积需大于组织体积30倍以上；组织沉底后即可包埋（该步骤可减少冷冻时产生的冰晶，防止组织结构破坏）。
包埋：组织包埋前应当确认好包埋方向，确保组织周围OCT内无气泡（有气泡可用无酶枪头吸去），包埋完成后置于-80℃冰箱保存或采用干冰速冻，做好标记。
3）石蜡包埋：组织结构保存良好，组织结构清晰，常温或4℃可长期保存，但步骤较繁琐，且由于石蜡包埋过程中使用的化学固定剂会与蛋白质形成交叉连接，影响核酸探针穿透，因而杂交信号可能稍低于冰冻切片。一般自身荧光背景较强，容易造成结果干扰的组织优先选择石蜡包埋处理方法，在一定程度上可降低背景对后续实验结果的干扰，临床肿瘤病理组织或者内脏器官往往采用这种包埋方式。
石蜡组织固定脱水包埋流程：
固定：组织固定结束后，用流水冲洗5 min，洗去渗入组织中的固定液，以免影响对组织内部结构的观察。
酒精梯度脱水：梯度脱水，使组织表面与内部均一性脱水，以避免组织因迅速脱水导致结构变形。
二甲苯透明：溶出组织内脂肪和多余酒精，方便石蜡浸入。
浸蜡：去除组织中的二甲苯，支撑组织中细胞结构以便后期切片观察。
表1.石蜡组织脱水程序
包埋流程：
[if !supportLists]1) [endif]核对标本：打开包埋盒，核实该包埋盒内组织与取材描述信息是否相符；
[if !supportLists]2) [endif]放入组织：选取合适包埋模具，从包埋机中把熔化的石蜡注入到包埋模具，按组织包埋方向，夹取组织块，放入包埋模具底面的中央处，轻轻压平；
[if !supportLists]3) [endif]冷冻定位：将包埋模具移到冷却台冷却片刻，固定组织块位置；
[if !supportLists]4) [endif]盖包埋盒：将相应的包埋盒盖于包埋模具上；
[if !supportLists]5) [endif]再次注蜡：注入足够石蜡，再移至包埋机冷台进行冷却；
[if !supportLists]6) [endif]剥离蜡块：充分冷却凝固后，从包埋模具中剥离出凝固的包埋蜡块。
总之，正确与规范的固定、包埋过程是确保获得高质量组织样品实验结果的前提，有助于后续准确分析细胞形态、组织结构和生物分子空间分布。针对不同的样品类型与实验需求也需要选择合适的固定与包埋方式。后续小编将持续为大家输出基因原位杂交技术相关知识，满满干货，敬请期待。
