植物的生长、抗逆、果实发育……背后都藏着「代谢物-蛋白互作（PMI）」的秘密。比如激素结合受体调控生长，次生代谢物结合酶影响防御通路——但传统研究要么只能逐个验证，要么需要修饰小分子配体，不仅效率低，还可能破坏互作本身。
现在有了有限蛋白酶解耦合质谱（LiP-MS）技术！它不用改变化合物结构，还能高通量找到植物里的PMI，甚至定位结合位点。今天就带大家吃透这份《Cell-Wide Identification of Metabolite-Protein Interactions》里的植物专属 LiP-MS 方案，从原理到实操一步到位～
一、LiP-MS：为什么能成为植物 PMI 研究的 “黑马”？
先搞懂核心逻辑：代谢物结合会改变蛋白结构，而结构变化会影响蛋白酶的“切割偏好”。
比如某蛋白没结合代谢物时，表面有很多蛋白酶切位点，会被切成短肽；一旦结合代谢物，结构折叠或打开，有些位点被遮住、有些新位点暴露——通过质谱对比“代谢物处理组”和“对照组”的肽段差异，就能锁定哪些蛋白和代谢物互作，甚至找到结合后结构变了的区域（也就是潜在结合位点）。
对比传统技术，优势突出
✅ 不用修饰配体：直接用天然代谢物，避免改变化合物活性
✅ 覆盖范围广：拟南芥、番茄、地钱等植物都能用（文档已验证）
✅ 信息量大：不仅找互作蛋白，还能定位结合相关的结构区域
✅ 高通量：一次实验分析全蛋白组，不用逐个验证
二、植物LiP-MS实操指南——每步都为植物“量身优化
图1 适用于植物的LiP-MS实验流程图
第一步：准备“有活性”的植物蛋白
（原生提取是关键）
磨样：温柔点，别把蛋白“搓变性”
● 材料选择：拟南芥幼苗（5天苗龄）、番茄毛状根（4周培养）、地钱叶状体（2周生长）,新鲜样本或-80℃冻存的都可以；
● 研磨与裂解：液氮磨成粉，用 100mM HEPES 缓冲液（含 150mM KCl、1mM MgCl₂，pH7.5）悬浮，反复冻融 3 次裂解细胞，离心去 debris（20000×g，4℃，10min） ，全程别让样品化冻——不然蛋白遇热会“变性摆烂”；
● 脱盐除杂质：用 NAP™-5 柱脱除 endogenous 代谢物（避免干扰后续实验）， Bradford 法测蛋白浓度，保证终浓度～1000μg/mL。
第二步：代谢物孵育 + 双酶解
（核心差异步骤）
这一步是 LiP-MS 的 “灵魂”，要精准控制时间和温度：
● 分组孵育：把蛋白分成 “代谢物组” 和 “对照组”，比如加 25mM ATP（代谢物）vs 加缓冲液（对照），25℃孵育 10min（摇床 300rpm）；
● 有限蛋白酶解（蛋白酶 K）：加蛋白酶 K（酶：蛋白 = 1:100 w/w），25℃孵育 5min—— 注意！时间不能超，不然蛋白会被切太碎；
● 终止蛋白酶 K：98℃加热 3min，让蛋白酶 K 变性（不可逆，避免继续切割）；
● 完全酶解（胰蛋白酶）：加胰蛋白酶 / Lys-C 混合酶（酶：蛋白 = 1:50 w/w），37℃孵育 16h，把蛋白切成能进质谱的短肽。
第三步：质谱分析+数据解读
肽段准备好后，就交给质谱和数据分析工具：
● 质谱检测：用 Q-Exactive-HF 质谱，搭配纳米 LC（C18 柱），数据依赖采集（DDA）或数据非依赖采集（DIA）都可以（推荐 DDA+DIA 结合，提高覆盖率）。
● 数据分析：
①用 MaxQuant 匹配植物蛋白数据库（比如番茄 UniProt 库），找差异肽段；
②用 R 包 DEP 或 Protti 做统计分析，筛选 log₂FC>1 且 q<0.01 的肽段；
③画火山图：X 轴是 log₂FC（代谢物组 vs 对照组），Y 轴是 - log₁₀q 值，红点就是差异显著的肽段（对应互作相关的蛋白区域）。
● 案例：番茄毛状根经25 mM ATP处理后，甘油醛-3-磷酸脱氢酶（GAPDH）的2个肽段丰度显著升高——后续验证发现ATP结合这个蛋白，火山图里显著差异的肽段，对应了 ATP 结合的激酶、代谢酶，后续实验还找到了结合后构象变化的区域。
图2 番茄毛状根经ATP处理的LiP-MS火山图
三、植物 LiP-MS 避坑指南
❶ 代谢物溶解度：尽量用缓冲液溶， DMSO 等溶剂终浓度别超 1%，否则会让蛋白变性；
❷ 孵育时间要准：从代谢物加样到蛋白酶 K 终止，每个样本的时间差不能超 30s，不然重复率会低；
❸ 质谱前脱盐：用 C18 柱脱盐时别过度干燥，不然肽段会损失。
❹ 生物学重复：至少 3 次重复，减少样本误差。
四、LiP-MS 能解决哪些植物科学问题？
● 植物生长发育机制研究：如赤霉素（GA）调控作物拔节、油菜素内酯（BR）调控果实膨大，通过体内 LiP-MS 找到 GA/BR 结合的靶点蛋白，解析其如何通过 PMI 调控细胞分裂、伸长通路；
● 植物抗逆机制解析：针对盐、干旱、病害等胁迫条件下积累的小分子（如脯氨酸、甜菜碱、植保素），通过体内 LiP-MS 筛选关键互作蛋白，揭示 PMI 在抗逆信号传导、代谢重编程中的作用；
● 作物品质调控机制研究：如番茄红素调控番茄果实成熟、花青素影响作物营养品质，通过体内处理 + LiP-MS，找到小分子结合的品质相关蛋白（如酶、转运体），解析品质形成的 PMI 调控网络。
五、小结
LiP-MS 就像给植物PMI研究装了“显微镜”——不用改造分子，不用逐个筛选，就能高通量找到互作蛋白和结合位点。文档里的方案已经在番茄、拟南芥上验证过，跟着步骤走，新手也能上手。
如果想深入看细节，比如具体缓冲液配方、质谱参数设置，可以去原文中的第 5 章找到植物适配方案和第 6 章的LiP-Quant 多剂量优化方案，里面还有完整的 R 分析脚本链接哦～
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