PCR技术及试题

PCR技术发明的过程那是十分的狗血：（转载）

1983年，Cetus生物公司的职员凯利·穆利斯和女同事约会的时候磕了些迷幻剂，嗑药后驾车在高速公路飞驰时（危险动作切勿模仿），路边的两排路灯在他眼前幻化作DNA双链，在他眼前不断离合、延伸……穆利斯意识到，他发现了扩增DNA的方法！

在1985年PCR技术初见成果的时候，Cetus公司催穆利斯赶紧把这技术写论文投稿，但穆利斯沉迷电脑游戏迟迟懒得动笔，公司为了赶时间，让技术员先写了篇论文投Science，等重度拖延症患者穆利斯终于写好论文想投稿时，关于PCR的论文已经不新鲜了。穆利斯表示被公司其他人抢了功劳很不爽，参加完沃森的“人类分子生物学”会议后不久就辞职离开。

穆利斯辞职时，只拿了一万美元和五个月薪水，日后PCR技术的巨额利润，都没他什么事了。他后来辗转在几家生物公司工作，靠着“PCR发明者”的名头，也能混碗饭吃。

他就这样一直浪着，还迷上了冲浪，在1993年的一个清晨，他冲浪回来被一群记者包围，他才知道，他凭PCR技术获得了诺贝尔奖！

大神的世界，我们不懂啊！

不如看几个题目^_^

1．实时荧光 RT-PCR可用于RNA病毒的核酸检测，其原理是∶在 PCR复性过程中探针和引物一起与模板结合，探针两侧分别带有荧光基团和抑制荧光发出的淬灭基团，新链延伸过程中，DNA 聚合酶会破坏探针，导致荧光基团与淬灭基团分离而发出荧光。利用 RT-PCR 进行核酸检测的相关过程如图所示。下列说法错误的是（ ）

A．做 RT-PCR 之前，需要先根据 cDNA 的核苷酸序列合成引物和探针

B．RNA不能作为 PCR扩增的模板，故需要将样本中的 RNA反转录为 DNA后再进行扩增

C．若检测结果有强烈荧光信号发出，说明被检测者没有感染病毒

D．病毒的检测还可以检测病毒的物质或病毒引发产生的抗体，其原理都是抗原-抗体杂交

2.“实时荧光定量RT-PCR”是新冠疫情防控的一把利刃，通常在l～2h内即可得到检测结果。TaqMan探针是实时荧光定量RT-PCR技术中一种常用探针（如图1），其5末端连接荧光基团（R），3末端连接淬灭剂（Q）。当探针完整时，R发出的荧光信号被Q吸收而不发荧光。在PCR扩增过程中，当Taq酶遇到探针时会使探针水解而释放出游离的R和Q，R发出的荧光信号被相应仪器检测到，荧光信号的累积与PCR产物数量完全同步（如图2）。请据图回答：

 （1）结合图1和图2分析，“荧光RT-PCR技术”所用的试剂盒中通常都应该含有 ______ 酶、 ______ 酶、TaqMan探针、引物、dNTP、Mg2+、缓冲剂系等。这种分子层面的荧光RT-PCR检测具有特异性和灵敏性都很高的特点，主要与试剂盒中的 ______ 、 ______ 有关。 （2）根据Taq Man探针功能分析，探针中碱基序列的设计应主要依据 ______ 。新冠病毒（nCoV-2019）是冠状病毒大家庭中的新的一员，其碱基序列与引起SARS的冠状病毒碱基序列有79.5%的相似性，与流感病毒碱基相似度也较高，因此在设计Taq Man探针时应筛选出nCoV-2019特有序列，以避免 ______ （填“假阴性”或“假阳性”）的出现。 （3）根据图1和图2，Taq酶的除了能催化DNA子链的延伸，还能 ______ 。 （4）若每分子探针水解释放的R基团荧光强度为定值a，则反应体系中某时刻荧光信号强度（Rn）主要与 ______ 、 ______ 有关。在检测过程中，随着PCR的进行，反应产物不断累积，“杂交双链”荧光信号的强度也等比例增加，加了保证检测结果的准确性，一般要达到或超过阈值时才确诊。可通过荧光强度的变化监测产生量的变化从而得到一条荧光扩增曲线图（如图3）。“平台期”出现的最可能的原因是试剂盒中 ______ 等有限，超出一定的循环数后，荧光标记的“杂交双链”不再增加。 （5）虽然荧光RT-PCR是当前被广泛认可的检测手段之一，但是不断有“假阴性”现象报道，通过上述过程分析，“假阴性”的可能原因有 ______ （填字母）。 a.通过咽拭子取样不规范或取样所获样本量不足 b.在样本运输、检测中出现了损坏和污染 c.病毒相应关键序列发生了基因突变

【答案】逆（反）转录Taq引物  TaqMan探针  新冠病毒RNA内部的一段序列（新冠病毒RNA逆转录形成的DNA的部分序列）  假阳性  催化RNA（TaqMan探针）的水解  扩增次数  样品中病毒初始数量（病毒样品模板RNA含量）  原料、引物和探针数量（Taq酶活性）  abc