本文选自Nature ，https://doi.org/10.1038/s41586-020-2066-6，喜欢的朋友可以自行下载。
Decoy exosomes provide protection against bacterial toxins.
书接上文，最近脑子一直不灵光，总是被ATG16L1，ADAM10，自噬，自噬底物，总ADAM10，细胞表面ADAM10等困惑着，我觉得有必要学习一下自噬是什么玩意儿，好正确理解昨天的内容，所谓自噬，就是自己吃自己的意思，是细胞利用自身物质进行物质代谢的一种方式，一般是在应激刺激条件下诱发（比如在地震中人没吃没喝的时候，为了活着，都是自给自足，你懂的），这是一种保护机制，但是刺激过强或者持续，细胞代谢出现问题，会出现自噬诱导的细胞死亡，同时自噬与抗药性，肿瘤发生，肿瘤抑制都有作用。现在也是一个很火热的研究领域，自噬分为四类，一种是巨自噬，一种微自噬，一种是分子介导的自噬，一种是分泌性自噬。故名思义就行了，前两个都是膜包绕的自噬，第一种是来自内质网和线粒体膜，第二种来自质膜，第四种不知道（猜测来自内质网）。好了，那么我们是不是要进一步解释一下自噬的过程，以巨自噬为例（一下自简友文章，具体可以跳转进一步学习）内质网和高尔基体等形成环状结构，包裹胞内结构形成双层膜囊泡结构，即自噬体；然后自噬体与溶酶体融合；自噬体内蛋白或者细胞器在溶酶体内被溶酶体酶讲解。（三类标志物：囊泡形成过程的标志物、溶酶体标志物、自噬底物标志物），
囊泡形成过程的标志物: （1） Atg12-Atg5复合物---WB检测：Atg12--15 kDa；Atg5--32 kD；复合体--55 kDa；（2）Atg16L1--Atg12-Atg5- Atg16L1复合物，不过自噬体形成后就离开了；检测早期自噬体的形成-方法：进行免疫透射电镜和免疫染色的检测；（3）LC3参与了自噬体膜的形成，包括相互转化的形式即LC3-I和LC3-II（细胞内新合成的LC3经过加工, 成为胞浆可溶形式的LC3-I, 后者经泛素化加工修饰, 与自噬体膜表面的PE结合, 成为膜结合形式的LC3-II。LC3-II定位于前自噬体和自噬体, 是自噬体的标志分子, 随自噬体膜的增多而增加）；检测方法--WB ： LC3-I 18 kDa, LC3-II 16 kDa；（尽管PE偶联形式的LC3-II的分子质量较LC3-I大, 但是其具有强疏水性, 因此在SDS-PAGE中电泳迁移率反而比LC3-I (非PE偶联的LC3) 快，可以通过Western blot比较组间LC3-II水平, 也可通过计算LC3-II/LC3-I的比值来评价LC3-II水平, 并推测自噬囊泡数量的多少。）注意：LC3在含SDS的样品裂解液中易降解, 因此样品经煮沸裂解后应当尽快进行Western blot实验,并避免反复冻融。 （4）Atg9/mAtg9 --Atg蛋白中唯一的跨膜蛋白；哺乳动物细胞的为mAtg9，在形成成熟自噬体后,mAtg9并未整合进自噬体囊泡上, 而是又游离进入胞浆；用来检测为自噬的发生；（5）Atg6/Beclin1：用荧光显微镜或透射电镜可检测Beclin1-GFP的点状聚集或斑块作为自噬标志物
溶酶体标志物：一般为溶酶体膜蛋白：溶酶体相关膜蛋白1 (lysosome-associated membrane protein type 1, LAMP- 1)、LAMP-2和溶酶体整合膜蛋白 (lysosomal integral membrane protein, LIMP-2)--检测方法：可用免疫组化或Western blot的方法检测溶酶体重要膜蛋白的水平, 并与其他自噬相关蛋白结合使用。
自噬底物标志物：p62也被称为SQSTM1, 在多种细胞和组织中 都有表达, 可作为一个货车蛋白参与多种信号转导过程。p62可连接LC3和泛素化的底物, 随后被整合到自噬体中, 并在自噬溶酶体中被降解；当自噬被激活时自噬体与溶酶体融合,自噬囊泡中p62等蛋 白或细胞器被溶酶体酶降解, p62水平降低; 当自噬被抑制时自噬体积累, p62水平升高。因此, 可以用Western blot方法检测p62的水平, 作为自噬能力变化的指征。
学完了这些是不是对昨天的内容了解的又多了些。
作者做到这些菜提到外泌体的作用，我也是服了。然后作者用了不同的灭活菌去验证到底是什么内容可以诱导外泌体升高，热灭活的金黄色葡萄球菌(CA-MRSA
USA300，以下简称HKSA)、一株同基因的α毒素缺失的USA300菌株(ΔHLA)、肺炎链球菌、轮齿柠檬酸杆菌和鼠伤寒沙门氏菌都能增加人和小鼠细胞的外泌体产量，在测试了几种细菌衍生产品后，我们确定细菌DNA和CpG DNA为外泌体诱导剂。用细菌的DNA可以诱导外泌体产生，但是加入DNAase后，作用被中和。
对HKSA和CpG DNA的反应依赖于内体DNA传感器Toll样受体9(TLR9)的外体产生。
但是，应用自噬诱导剂却没有增加外泌体含量，所以说TLR9通过一种不同的机制发挥作用
相反，单独或联合加入CpGDNA或巴菲霉素(阳性对照)可减少酸性细胞器的指示剂LysoSensor染色，用中性鞘磷脂酶抑制剂GW4869处理细胞-它通过干扰多泡体(MVB)的向内萌发来防止成为外体的囊泡的产生-损害了CpG-DNA诱导的外体产生。
作者把灭活的金葡菌接种到WT鼠中，对比HM鼠，外泌体产生增多。但是巨噬细胞和树突状细胞谱系中选择性缺失ATG16L1的小鼠中没有明显增加。（说明这种外泌体主要是巨噬细胞和树突状细胞产生的？）
作者研究也发现了，巨噬细胞和树突状细胞谱系中选择性缺失ATG16L1的小鼠更不容易受到金葡菌感染致死（相比HM鼠）。然后，作者用HKSA和cpgDNA诱导鼠外泌体产生，做了外泌体内容物质谱分析，大多数检测到的蛋白质来自肝脏，证实肝酶精氨酸琥珀酸合成酶1(ASS1)在HKSA和CpG DNA在活体诱导外泌体中。
这些诱导的外泌体是否可以结合细菌毒素呢？作者又进一步验证了。发现，从对照供体细胞分离的外切体，而不是从ATG16L1基因敲除细胞分离的外泌体，能够保护A549靶细胞免受α毒素的毒性。用两倍ATG16L1-敲除细胞上清液提取的外泌体可以保护A549细胞，表明ATG16L1-敲除细胞的外泌体不能保护细胞是由于外切体数量减少所致。从ADAM10基因敲除的细胞中获得的外切体不能保护细胞。值得注意的是，用HKSA或CpGDNA预先孵育细胞也能保护细胞免受α毒素的毒害。发现了外泌体具有保护作用，而且这种保护作用是通过结合毒素起到的作用。
从小鼠骨髓来源的巨噬细胞(BMDM)诱导的外泌体含有毒素受体CCR5，并保护BMDM免受LukED的影响（LukED是金黄色葡萄球菌产生的另一种毒素）。同样，从A549细胞分离的外泌体保护靶细胞免受白喉毒素的影响（白喉毒素是一种由白喉棒杆菌产生的有效毒素），它能与表皮生长因子受体(EGFR)结合，而表皮生长因子受体(EGFR)是A549外泌切体蛋白质组学数据集中的组成部分.这里作者只是补充说明了外泌体可以结合细菌毒素，起到保护作用。
最后作者再来验证这种外泌体是否在体内也有保护作用。给供体小鼠注射了HKSA，以诱导血液中的外泌体；然后将这些外泌体转移到受体小鼠体内，并用致死剂量的金黄色葡萄球菌感染动物。来自野生型但不是HM鼠者的外泌体转移延长了感染金黄色葡萄球菌的野生型受体小鼠的存活。
作者发现，在金黄色葡萄球菌感染后，用HKSA调节小鼠的存活时间延长了，表型复制与感染ΔHLA株的对照组小鼠相似。为了监测细菌负荷，我们用较低的接种量挑战小鼠，发现用HKSA进行预处理可以减少肾脏和血液中金黄色葡萄球菌的负荷。
至此，本文结束了，大佬的文章，再次总结一下。作者在该文把自噬和外泌体分泌结合起来，阐述了一种以ATG依赖性的外泌体产生在细胞对外毒素起到的保护作用，简单说明了其中一些机制，这种外泌体产生是需要TLR9介导，具体机制不明。前面大部分都在说机制，后面一直在验证功能，这种写作手法，我也是活久见。作者就是发现了一个问题就去研究了这个问题，我觉得完全没有什么临床意义啊，真正的为了科研而科研，不像我，是个俗人，nature就是不一样。我沉默了。感觉做的很乱，没有串联起来的线啊，读着也费尽，我觉得大道至简，这种写作方法是没有灵魂的。别废话，上个图聊表我此刻的心情。
