本文的思路是通过单细胞数据分析识别了某种免疫细胞特有的marker基因，然后利用这些基因进行预后模型的构建。事实上，预后模型的文章已经不好发了，甚至有的审稿人看到预后模型就反感，因为实在是太多了，而且预测效能普遍不行。那么如何做的比这篇文章还要好呢？
鉴于最近泛癌分析以及肿瘤分型分析比较好发，小编做的免疫细胞marker的泛癌分析以及肿瘤分型，内容是这些文章的2倍以上，均发表到8+杂志。所以我们在筛选到某种免疫细胞特有的marker基因后，可以对这些基因进行泛癌分析或者肿瘤分型分析。在分型分析中再附上简单的预后模型，但不以其为重点。这样的思路肯定是比本篇文章内容更多，更新颖。如果想做类似分析，欢迎交流。
研究背景：
组织常驻巨噬细胞(Tissue-resident macrophages, RTMs)是来源于胚胎前体细胞的异质免疫细胞群，也是肿瘤浸润巨噬细胞的一部分。RTM在乳腺癌(BC)中发挥抗肿瘤活性，表明它们的存在可能预测免疫治疗反应。免疫检查点疗法(ICT)已被证明是一种有前途的乳腺癌(BC)治疗方法，但大多数BC患者对ICT没有反应，并且没有经过验证的预测生物标志物。因此，迫切需要确定一种有价值的生物标志物来预测BC患者的ICT结局。
研究结果：
一、BC中RTM的鉴定
1、基于先前BC研究的单细胞数据，我们使用Seurat包对原始单细胞进行精细聚类。这些细胞被分为免疫细胞(CD45+)和非免疫细胞(CD45-)，并通过UMAP进行可视化(图1A)。
2、为了进一步鉴定这些免疫细胞的细胞亚簇，将免疫细胞分别重新聚成簇(图1B)，并使用簇特异性基因与以往研究中记录的经典标记一起注释细胞类型。
3、所有来自BC组织的表达巨噬细胞标记的髓系细胞(图1C)分别重新聚类，以进一步鉴定RTM。
4、4个巨噬细胞簇(RTM_1-RTM_4)与先前报道的中驻留巨噬细胞的特征一致，包括MHCII的高表达(如HLA-DMB、HLA-DRB5、HLA-DQA1、HLA-DOB、HLA-DPB1、HLA-DPA1等)、CD11b/ITGAM和MRC1(图1D、E)，称为TYM，其余簇称为肿瘤相关巨噬细胞(TAM_1-TAM_5)。
5、揭示了4个RTM集群中RTM集群特异性基因的表达谱(图1F)。在所有RTM聚类中均观察到FCGR3A高表达(图1F)。先前的研究表明，骨髓细胞上的FCGR3被激动性CD40抗体激活，导致树突状细胞成熟和CD8+ T细胞激活。还观察到RTM_2聚类唯一表达MARCO(图1F)。
6、既往研究表明MARCO可通过巨噬细胞特异性表达，并介导肿瘤细胞的清除。RTM_3簇显示高表达CCL5(图1F)。在之前的一项研究中，发现CCL5与巨噬细胞表达的CXCL9相互作用，导致T细胞浸润增加，抑制肿瘤进展[23]。此外，RTM_4簇显示一个独特的NLRP3表达和一个高的FOLR2表达(图1F)。
7、具有代表性的RTM特异性标志物MARCO和FOLR2在CD68+巨噬细胞中表达(图1G,H)。
二、RTM中显著通路的富集
1、巨噬细胞的基因集变异分析(GSVA)显示信号通路富集于巨噬细胞簇，突出表明所有RTM簇，即RTM_1、RTM_2、RTM_3和RTM_4具有相似的特征(图2A)。值得注意的是，炎症反应和TNFα信号，如前所述的M1巨噬细胞的两个重要标志，在每个RTM簇中都得到了富集(图2A)。
2、同时，观察到干扰素反应、Notch通路和TGFB信号，这三个重要的特征M2-like巨噬细胞，如前所述，在每个RTM簇中都被富集(图2A)。
3、此外，发现每个RTM聚类都高表达免疫检查点基因(图2B)。这一结果表明，RTMs可能是晚期或复发性BC的新的免疫治疗靶点。
4、将巨噬细胞分为TAM组和RTM组，根据RTM在BC中的相似特征来研究RTM在BC中的作用(图2C)。
5、RTM具有高度的差异，与TAMs相比，有4000个基因以1%的错误发现率(FDR)差异表达(图2D)。
6、KEGG和差异表达基因(DEGs)的基因集富集分析(GSEA)显示，RTM中吞噬体途径和抗原加工和呈递途径富集(图2E,F)。
三、各RTM聚类的免疫特征
1、为了研究每个RTM聚类在BC肿瘤微环境中的作用，使用CIBERSORT算法分析了每个RTM聚类的两个亚型与每个BC样本的22个人类免疫细胞亚群之间的相关性。
2、M1巨噬细胞、CD8T细胞、静息记忆CD8T细胞、活化NK细胞、γ δ T细胞、单核细胞和静息树突状细胞在每个RTM聚类高的亚组中更丰富，而M0巨噬细胞、naïve B细胞和T调节细胞(Tregs)在每个RTM聚类低的亚组中更丰富(图3)。
四、不同RTM聚类的预后分析
1、利用METABRIC数据库的现有基因表达数据，进一步评估了在无外部免疫治疗压力的环境中鉴定的RTM聚类的预后相关性。
2、如图4A-E所示，所有RTM聚类，除RTM_2聚类外，均与BC患者总生存率的改善显著相关。乳腺癌的预后与较高的肿瘤浸润淋巴细胞(TIL)水平相关，这些结果与不同的RTM聚类具有相似的免疫调节功能作用一致。
3、利用METABRIC数据库探讨了TAM聚类与预后之间的关系。
五、RTM集群与ICT敏感性相关
1、最近一项关于RTMs与CD8+ T细胞浸润正相关的研究表明，RTMs可以增强ICT反应。如图5A所示，观察到T细胞溶解指数与各RTM聚类的基因特征正相关。
2、根据RECIST(实体瘤疗效评价标准)，BC患者的疗效分类如下:有反应者(R)为完全缓解(CR)和部分缓解(PR)，无反应者(NR)为病情稳定(SD)和进展性疾病(PD)。通过GSEA，观察到应答患者(n = 16)与非应答患者(n = 27)相比，应答患者(n = 27)中每个RTM聚类(RTM_4聚类除外)的特定基因标记显著富集(图5B)。
3、比较了每个RTM集群中应答者和非应答者的内容。证实，应答者的每个聚类表达均显著高于无应答者(图5C)。
六、ICT疗效预测模型构建
1、由于响应患者中每个RTM聚类的表达和基因标记的富集在响应患者中显著高于无响应患者，假设这些聚类的特征基因的表达可以预测ICT的结局。
2、为了验证这一假设，基于scRNA-seq数据集和使用癌症类R包[30]的批量基因表达数据集GSE177043开发了一个ICT响应性签名。该特征被标记为RTM特征(RTM. sig)，对ICT结果具有显著的高预后价值。具体而言，对于初始发现数据集GSE177043 (N = 43，响应者[R] vs.非响应者[NR]: 16 vs. 27)， RTM.Sig的(曲线下面积)AUC为0.99(95%置信区间[CI]， 0.98 1)，灵敏度为100% (95% CI: 100 100%)，特异性为92.59% (95% CI: 81.48 100%)(图6A)。
3、对于验证数据集EGAD00001006608 (N = 29, R vs. NR: 20 vs. 9)， RTM.Sig也准确预测了BC患者的ICT结局，AUC为0.86 (95% CI: 0.73 1)，敏感性为80% (95% CI: 60 95%)，特异性为78% (95% CI: 44 100%)(图6B)。
4、为了进一步验证，下载并分析了GSE111414和GSE168204数据集。这些数据集包括抗PD-1免疫治疗的基因表达谱和临床信息。对于GSE111414数据集(N = 20, R vs. NR: 10 vs. 10)，选择预处理样本进行验证。RTM.Sig在鉴别NR和R肿瘤方面的AUC为0.90 (95% CI, 0.75 1)，敏感性为90% (95% CI: 70 100%)，特异性为80% (95% CI: 50 100%)(图6C)。
5、对于GSE168204数据集(N = 27, R vs NR: 18 vs 9)，选择预处理肿瘤样本进行验证。RTM.Sig准确预测ICT结果的AUC为0.96 (95% CI, 0.89 1)，敏感性为100% (95% CI: 100 100%)，特异性为89% (95% CI: 72 100%)(图6D)。
6、将RTM.Sig的预测性能与之前报道的其他基因签名进行了比较(表1)。
7、作为参考，在GSE177043数据集(图7A)中，建立的IMPRES预测精度排名第三，在EGAD00001006608数据集(图7B)中排名第五，在GSE111414数据集(图7C)中排名第六，在GSE168204数据集(图7D)中排名第四。这表明RTM.Sig是四个独立数据集中预测ICT结果的最佳生物标志物。
总结：
在这项研究中，进行了scRNA-seq分析，并鉴定了5个组织驻留巨噬细胞(RTM)簇，它们具有M1-M2巨噬细胞的混合表型。综合多组学数据分析显示，RTM聚类具有炎症反应和活性氧通路升高的特征，并与T细胞的细胞毒性和CD8+ T细胞和CD8+ T细胞的浸润呈正相关，表明对ICT的敏感性。因此，RTM聚类可以作为接受ICT治疗的BC患者临床决策的有价值的工具。
