Nat Biotech | 高通量单细胞蛋白质组学实现单日分析5000个细胞

原创 存在一棵树 图灵基因 2022-07-29 10:03 发表于江苏

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撰文：存在一棵树

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亮点：

开发名为 plexDIA 的实验框架，将肽的平行分析与样品的平行分析相结合，以实现通量的成倍增加可用于多路复用的样品分析，其在不降低蛋白质组覆盖率和准确性的前提下通过增加标签数量从而成倍地增加通量。

德国柏林Charité医学院定量蛋白质组学系教授Vadim Demichev与美国东北大学的Nikolai Slavov教授近期在《Nature Biotechnology 》上发表了一篇名为“Increasing the throughput of sensitive proteomics by plexDIA”的文章。本文开发一个通用框架和分析流程，以通过plexDIA提高定量蛋白质分析的吞吐量与灵敏度。

质谱 (MS)是可以实现高覆盖、低缺失、高通量和高灵敏度蛋白质组学分析的方法，但同时实现以上优势仍是一项巨大的挑战，特别是对于需要单细胞蛋白质分析的项目。为实现这一目标，通常通过以下两种策略来增加蛋白质分析的通量： 1) 通过化学标记提高样品通量和稳定性；2) 通过平行分析多重肽减少每个样品的MS分析时间。如图1所示，本团队联合以上两种策略，即数据独立采集 (DIA)策略结合非等压质量标签，以实现对有限样本量的蛋白质组进行量化速率的倍增。

这里团队评估了plexDIA相对于匹配的 LF-DIA 分析是否可以增加定量数据点的数量，且同时保持相似的定量准确性。如图2所示，将plexDIA与 LF-DIA直接应用于500 ng 蛋白质样品的分析以进行基准测试，发现与数据相关采集 (DDA)运行相比，DIA运行使plexDIA的吞吐量成倍增加；与LF-DIA相比，plexDIA 提高了跨样本的数据完整性，其定量精度和重复性与LF-DIA相似，对蛋白质丰度差异估计也相似，但在plexDIA 实现了与 LF-DIA 相似统计能力的前提下，其使用的仪器时间和费用减少了三倍。

除以上评估之外，该团队还应用 plexDIA 来量化 U-937 单核细胞整个细胞分裂周期(CDC) 的蛋白质丰度。首先，对来自分选细胞的肽用非等压同位素标记物进行标记；然后通过 MS1 优化 (V1) 和 MS2 优化 (V2) plexDIA 方法进行组合分析；使用 DIA-NN 分析 V1 和 V2 数据产生了 4,391 个独特的蛋白质组和 4,107 个基因组，随后将基因水平信息用于下游蛋白质集富集分析 (PSEA) 和差异蛋白质丰度分析；V1和 V2数据表明非常相似的 PSEA 模式，并确定了典型的CDC过程。如图3所示，预期的CDC动态以及V1 和V2结果之间的一致性证明了 plexDIA 在生物学研究中的实用性，其分析小样本的能力使得根据细胞的DNA含量从CDC的不同阶段分离出细胞成为可能。

随后，该团队还评估了 plexDIA 量化单个人类细胞中蛋白质的潜力。为测试其对不同类型的 MS 探测器、轨道阱和飞行时间 (TOF) 探测器的普遍适用性，以及利用离子淌度技术的能力，这里使用了timsTOF SCP和 Q Exactive classic两个商业平台来进行单细胞plexDIA 样本分析。如图4所示，plexDIA 分析产生的单细胞蛋白质组的数据完整性都很高，在timsTOF SCP 分析的标记集内超过98%，在Q Exactive中保持在50%以上；plexDIA 量化了跨越 1,000 倍动态范围的蛋白质倍数变化，并与从100个细胞大样本中量化的相应倍数变化表现出良好的一致性；表明plexDIA 可以提高单细胞蛋白质组分析的灵敏度，从而提高数据的完整性，尤其是在蛋白质组非常不同的细胞之间。

综上，本文证明了plexDIA可以通过使用DIA 分析、优化高plex 非等压质量标签进行缩放，从而大大增加敏感蛋白质分析的吞吐量和可访问性，且这种标签的设计和制造比等压标签更容易、更便宜。因此，将3-plexDIA 结果外推到 100-plexDIA，这使单个MS仪器每天的工作效率达到可分析5,000个细胞的蛋白质组成为可能。

教授介绍

Nikolai Slavov，美国东北大学生物学系和化学与化学生物学副教授。2004年在麻省理工学院（MIT）获得生物学学士学位，随后他在普林斯顿大学的Botstein实验室进行博士研究； 2010博士毕业后，在麻省理工学院的范奥德纳尔登实验室开始了一个博士后项目。获得了未扰动野生型细胞中核心核糖体蛋白之间差异化学计量的直接证据，该发现支持了具有不同蛋白质组成和生理功能的核糖体的存在，这些核糖体代表了已探索的调节基因表达层。其实验室的研究重点包括：单细胞蛋白质组学、核糖体介导的翻译调控、定量系统生物学与质谱。最近，Slavov实验室通过质谱（SCoPE-MS和SCoPE2）开发了高通量单细胞ProtEomics的方法，并使用它们来量化细胞分化过程中的蛋白质组异质性。

参考文献

Derks, Jason et al. “Increasing the throughput of sensitive proteomics by plexDIA.” Nature biotechnology, 10.1038/s41587-022-01389-w. 14 Jul. 2022.