Nature Cancer | 单细胞分析揭示肉瘤干细胞层级和发育起源

原创 骄阳似我 图灵基因 2022-09-02 09:35 发表于江苏

收录于合集#前沿生物大数据分析

撰文：骄阳似我

IF： 23.177  

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亮点：

1. 本文通过单细胞RNA测序和功能性干细胞分析，发现了RMS和人类肌肉发育中共享的肿瘤细胞层级结构，确定了肿瘤细胞常见的发育停滞阶段。融合阴性RMS细胞类似于胚胎和胎儿发育中的早期肌原细胞，而融合阳性RMS细胞表达高度特异性的基因程序，在从胚胎发育到胎儿发育的肌肉细胞中发现。融合阳性RMS细胞也具有丰富的神经通路状态，表明其对肌肉谱系层级的粘附性较低。

2.在融合阴性RMS中鉴定了一个肿瘤增殖亚群，该亚群与能产生肌肉和成骨细胞的双效肌间质祖细胞具有显著相似性。

横纹肌肉瘤（RMS）是一种常见的儿童癌症，与发育中的骨骼肌具有相同的特征。然而，细胞层级结构与人类肌肉发育的关系以及分子定义的肿瘤增殖细胞的鉴定尚未报道。

近期，在Nature cancer杂志上发表了一篇名为“Single-cell analysis and functional characterization uncover the stem cell hierarchies and developmental origins of rhabdomyosarcoma”的文章，发现了RMS和人类肌肉发育中共享的肿瘤细胞层级结构，确定了肿瘤细胞常见的发育停滞阶段；并且在融合阴性RMS中鉴定了一个肿瘤增殖亚群，该亚群与能产生肌肉和成骨细胞的双效肌间质祖细胞具有显著相似性。

scRNA序列显示RMS异质性。

为了研究RMS中的细胞状态和肌肉发育等级，对患者的异种移植物进行了10X scRNA序列分析。然后对细胞进行聚类分析，并使用均匀流形近似和投影（UMAP）渲染进行可视化。结合具有相似基因表达的细胞簇，并使用分子特征数据库分配保守的细胞状态。

从该分析中发现了常见的泛癌细胞状态，包括增殖、缺氧、凋亡、干扰素和内质网应激反应细胞特征。还发现RMS特异性细胞状态，包括：（1）表达MYLPF、ACTC1、LRRN1、TNNT3和TSPAN33的分化肌细胞群；（2） 表达细胞外基质和间充质基因的间充质富集群体（间充质样），其包括MMP2、CD44、PTN、POSTN和THY1（CD90）；和（3）仅在FP-RMS中发现的富含神经通路的细胞类型。

所有五个FN-RMS肿瘤都含有间充质富集细胞，而五个FP-RMS中只有两个含有该细胞亚群。最后，大多数FP-RMS含有富含神经通路的细胞，表明FP-RM肿瘤通常可以采用这些细胞状态作为转化过程的一部分。最后，所有患者衍生的RMS肿瘤都含有大量不能表达任何上述转录基因模块的细胞，并被指定为“基态”。这些数据表明，存在四种主要的、转录定义的RMS肿瘤细胞状态，包括增殖细胞、基态细胞、间充质细胞和分化的肌肉细胞。

图1：SCRNA-SEQ揭示了人类RMS中不同的细胞状态和肿瘤间异质性。

并非所有RMS细胞都能启动肿瘤生长。

为了公正地确定FN和FP-RMS PDX模型中肿瘤生长的潜伏期，将来自9个PDX的RMS细胞移植到NSG小鼠。与FP-RMS相比，FN-RMS重建肿瘤的速度更快。为了进一步研究单个RMS细胞是否能够重塑肿瘤并产生所有后续细胞状态，将来自四个PDX的单个肿瘤细胞植入NSG小鼠的侧翼。结果表明四个PDX中的三个在单细胞异种移植物植入后产生肿瘤，包括两个FN-和一个FP-RMS。这些结果证实，单个肿瘤细胞可以重新填充整个RMS细胞状态，包括FP-RMS中富含神经通路的细胞状态。

图2：单个RMS细胞可以重建癌症内的所有肿瘤细胞异质性。

RMS与胚胎/胎儿肌肉具有分子相似性。

Davicioni等人先前在原代人类RMS中鉴定了亚型特异性转录基因程序，假设亚型特异的转录程序可能与人类肌肉发育的特定阶段的停滞有关。使用来自每个肿瘤的scRNA序列数据的总和来确定基因表达，然后通过比较FP-和FN-PDX之间的基因表达来确定差异调节基因。将该基因列表与Davicioni等人确定的亚型特异性基因特征进行比较，以生成FN-RMS或FP-RMS的高度特异性核心特征基因图谱。结果表明，每个核心基因模块在所有肿瘤细胞中普遍且类似地表达，并且对FN-或FP-RMS高度特异。

接下来使用硅片缺失分析（LISA）算法预测每个核心特征中差异表达基因的转录调节因子。LISA查询了一组注释良好的组蛋白标记染色质免疫沉淀测序和染色质可及性图谱的大型数据集，以构建与查询基因列表的调节相关的染色质模型。LISA分析显示FP-RMS核心基因中PAX3位点的富集度较高。相比之下，FN-RMS核心特征没有预测的PAX3调节基因的高度富集。

为了测试亚型特异性核心特征是否在肌肉发育的特定阶段富集，将FP-和FN-RMS核心特征映射到人类胚胎、胎儿和成人肌肉细胞群。FN-RMS核心信号在分离自胚胎和胎儿发育的肌肉细胞中表达，但在成人肌肉中不表达。这些发现支持一个模型，两种RMS亚型都表达胚胎或胎儿肌肉中发现的基因程序，并发现FP-RMS细胞表达与严格控制的发育阶段相关的转录程序，在该发育阶段，肌原细胞从胚胎向胎儿肌肉发育过渡。

图3： RMS亚型共享共同的基因表达模式，并在胎儿和胚胎肌肉发育的不同阶段停止。

RMS细胞与胚胎/胎儿肌肉共享干细胞层级。

为了研究不同RMS细胞状态是否与人类胚胎和胎儿发育中发现的相似，接下来评估RMS和正常人类肌肉之间的基因表达模式。

首先量化了来自胚胎、胎儿和成人发育的人肌肉祖细胞、肌细胞/成肌细胞和骨骼肌间充质干细胞/祖细胞（SkM.Mesen）的scRNA序列中RMS转录基因模块的富集。通过基因富集分析（GSEA），RMS增殖基因模块在6-7周龄胚胎骨骼组织的人类肌肉祖细胞中富集，反映了与细胞周期和这些细胞在发育期间的快速扩增相关的共享肌肉特异性转录程序。相比之下，分化的RMS肌肉转录基因模块在一系列发育时间点（包括6-7、9和12-14周龄）的肌细胞/成肌细胞内富集。

间充质富集的RMS TPC在转录上与最近描述的SkM.Mesen高度相似。值得注意的是，间充质富集的TPC信号在SkM.Mesen中优先表达。在间充质细胞中，这些富含间充质的TPC表达成骨基因OGN（骨聚糖）和MGP（基质Gla蛋白）。使用qPCR和抗体共染色验证了间充质融合RMS细胞中OGN和MGP的高表达。这些数据验证了RMS TPC与SkM.Mesen的显著相似性。再次表明，6-7周龄胚胎肌肉的早期肌肉祖细胞基因特征在增殖RMS细胞中特异性富集。因此，FN-RMS细胞包含与早期人类肌肉发育中发现的细胞状态相似的细胞。

接下来评估了FN-RMS间充质富集的TPC生成成骨细胞类型的能力，如果这些细胞与双效SkM.Mesen具有相同的转录和功能，则可以预测成骨细胞的类型。从FN-MAST139、RD和381T细胞中分离FACS分选的间充质、分化的肌肉或反选择的细胞，并在成骨分化培养基中培养18d。三种模型的富含间充质的TPC产生的茜素红S+成骨谱系细胞显著增多，而反向选择和分化的肌细胞组分未能有效产生成骨细胞。这些数据支持FN-RMS TPC和最近定义的双电位SkM.Mesen之间共享干细胞的状态和功能。

图4：间充质富集的FN-RMS TPC与功能强大的SKM.Mesen具有转录和功能相似性。

本文通过单细胞转录组分析揭示了患者源性RMS的显著异质性。最值得注意的是，本文发现了一个独特的间充质样细胞群体，它表达间充质基因的高转录水平，并驱动FN-RMS肿瘤生长。该FN-RMS TPC与最近描述的人类SkM.Mesen在分子、发育和功能方面具有相似性。本文揭示了人类肌肉发育和RMS之间潜在细胞层级结构的显著守恒。还鉴定了FN-RMS中的一种分子定义的、基本上静止的TPC，该TPC在分子、发育和功能上与新近描述的双效肌肉间充质干/祖细胞相似。

教授介绍：

David M. Langenau

Langenau实验室的研究重点是揭示促进儿童癌症生长和肿瘤增殖细胞频率的复发机制。利用斑马鱼T细胞急性淋巴细胞白血病（T-ALL）和胚胎性横纹肌肉瘤（ERMS）模型，采用了化学和遗传学方法来识别生长和复发的新调节剂。具体研究工作是：

一、 T细胞急性淋巴细胞白血病复发相关驱动基因突变的发现

T-ALL是胸腺细胞的一种侵袭性恶性肿瘤，常规化疗可提高患者五年生存率。但复发患者对额外治疗基本无反应，预后非常差。Langenau实验室利用一种新的复发T-ALL斑马鱼模型和无偏生物信息学方法，发现了与攻击性、生长和复发倾向增加相关的新致癌驱动因素。Langenau实验室正在评估这些基因在调节T-ALL增殖、凋亡和人类疾病治疗反应中的作用。

二、胚胎性横纹肌肉瘤中肿瘤干细胞的可视化和杀伤

ERMS是一种常见的儿童软组织肉瘤。Langenau实验室开发了一种转基因斑马鱼模型，模拟了人类ERMS的分子基础。Langenau研究表明非肿瘤增殖细胞可能在癌症进展和促进转移中发挥重要的支持作用。在动态活细胞成像方法的基础上，Langenau实验室采用了化学遗传学方法来识别杀死复发相关、自我更新的myf5 GFP+ERMS细胞的药物。目前正在评估用于调节人ERMS细胞生长的药物子集。

参考文献：

Wei, Y., Qin, Q., Yan, C.et al.Single-cell analysis and functional characterization uncover the stem cell hierarchies and developmental origins of rhabdomyosarcoma.Nat Cancer3, 961–975 (2022). https://doi.org/10.1038/s43018-022-00414-w