病人样本数：360
测序深度： 80 （测序得到的碱基总量（bp）与基因组大小（Genome）的比值，它是评价测序量的指标之一。）
整体体细胞突变数从0.05到16.1（per megabase），中位数1.24。
promoter区间定义为：TSS上游400bp到下游250bp。
Discovery of recurrently mutated promoters
探索不正常的突变需要细致地考虑背景突变率，它很容易被多种基因组因素所影响。
编码区：
- 病人特异的覆盖率信息
- 病人特异的整体突变率
- 基因组上突变率的协变量
- 突变簇
启动子区采用类似的策略，但不像编码区是基于沉默编码和附近非编码区突变进行估计，因为不知道哪些是非功能性的，所以非编码区基因基因组所有突变进行估计。
考量启动子的几个标准：
- 整体突变超过预期
- 不寻常的突变簇；同时考虑特定的转录因子结合位点
研究考虑到乳腺肿瘤中一些由apolipoprotein B messenger RNA-editing enzyme catalytic (APOBEC) cytidine deaminases （载脂蛋白B信使RNA编辑酶催化的胞甘脱氨酶）调控的突变进程的高度活动。
这些突变享有共同的特征序列语境（TCW，W指代A/T）。因为不大可能对此建立完美的模型，作者通过他们开发的SignatureAnalyzer工具(1)识别整体突变谱表面为高APOBEC活动的病人；(2)基于病人中APOBEC整体的活动度，给由APOBEC引起的突变赋予一个概率。APOBEC概率大于80%的突变都被移除。
研究分析找到了9个热点突变的promoter元件：FOXA1 (an established breast cancer oncogene), TBC1D12, RMRP/CCDC1107(bidirectional promoter), NEAT1, LEPROTL1, ALDOA, ZNF143, CITED2, 以及 CTNNB1 （错误发现率FDR<0.1）。
（Figure1 | Identification of significantly mutated promoters）
图a可以看到有10个筛选出来的重要突变，其中有两个是双向promoter(?)。所以可以一一对应到b图中9个子图。
b图非常复杂，我们观察单个子图理解含义。
横轴表示碱基的位置，下方绘制了它对应或临近的基因组元件。
左侧纵轴表示突变数，对应图中的棒棒糖高度；右侧纵轴为覆盖率，表征白色背景下的灰色峰变化；最右侧标尺为探测的灵敏度，对应了图中蓝色变化曲线。
b图9个子图中有6个为hotspot突变，3个为突变簇（三个左侧纵轴为0-3|4的）。
图中的核心是堆砌的棒棒糖图，红色代表文章研究找到的突变数，绿色代表TCGA全基因组突变数，紫色代表BRCA560这个项目的突变数。
这些图表达的分析思路是：通过预期和实际观察突变率的不同找到了一些有用的promoter突变位点，进一步通过其他两个数据集进行对比验证。
既然已经找到了，接下来便是通过实验检验一下一两个重要的突变位点。
Mutations affect expression and affinity
两类实验：
下面看下实验结果和分析：
（Figure 2 | Functional characterization of promoter mutations）
a,b图可以看到突变后酶活性增强，蛋白结合能力增强，表明序列突变增强了对转录因子的招募；这和我们已知的FOXA1基因是原癌基因（原癌基因突变后获得功能，gain-of-function），RMRP在上皮细胞中显著扩增是统一的。报道称RMRP参与了转录调控，这里对于乳腺癌的影响未知。
c图与a，b图相反，可以看到4个突变中的3个突变都导致了酶活性的下降和蛋白结合能力下降。另一个活性轻微增强。与功能丧失的表型一致，发现8%乳腺癌中该基因有针对性地被删除，外显子区域也出现了重复突变。
其他突变的promoter序列荧光素酶活性都有显著性下降，但是蛋白结合结果差异不明显。它们都被放在附加数据中进行讨论。
FOXA1 promoter mutations act through E2F
因为大家对FOXA1在乳腺癌中的作用所知甚深，所以这里作者选择它对promoter突变所造成的功能影响进行更精确的分析。
（Figure 3 | FOXA1 mutations act through E2F and increase tolerance to anti-oestrogen receptor treatment）
Motif分析发现它的突变可能为E2F家族创造了一个更强的结合位点（Figure 3a）。
为了验证，作者做了4个实验：
- 重复EMSA实验，选择对E2F有强亲和力的DNA片段作为竞争物，以不结合的探针作为对照。可以发现，在WT E2F竞争物存在的情况下，E2F不跟野生或突变的promoter结合，实验表明E2F参与了FOXA1 promoter的结合。有意思的是，作者没有提到加上突变竞争物和核提取物时，突变的promoter有比较好的结合力，但是加野生竞争物和核提取物时反而没有了，这一点怎么解释呢？
- 用子宫外共表达的E2F3和它的协因子（co-factor）DP1重复了荧光素酶报告基因实验。Figure 3c 可以看到加入E2F/DP1共表达后，酶活性都有显著性上升，特别是突变promoter组。
- pull-down实验（Figure 3d, 3e），用生物素标记的FOXA1的WT和突变体pull down细胞核提取物。发现突变的FOXA1探针与E2F1或E2F3/DP1蛋白结合能力比野生型强。
- ChIP-seq检测MCF-7乳腺癌细胞，发现了6bp的高亲和motif（Figure 3f），t检验显示突变与野生型有显著性差异。
这些实验的结果都表明了E2F的结合至少部分调控了由FOXA1 promoter突变导致的表达改变。
FOXA1是一个转录先驱因子，它打开染色质以便于ER（雌激素受体）接近它的基因组靶点。在恶性肿瘤和乳腺癌转移中有观察到FOXA1的高表达，它重编程了ER结合谱（binding landscape）。
作者假设FOXA1蛋白的富集会增强ER的活性。为了检测这一假设的正确性，作者用MCF-7细胞系过表达FOXA1，并用ER的拮抗剂fulvestrant（一种复合物，用来治疗激素受体阳性乳腺癌）进行treat。发现过表达的细胞比对照组长得快（Figure 3g），说明乳腺癌中上调的FOXA1水平提升了细胞对抗ER治疗的容忍度。
（Figure 3 | FOXA1 mutations act through E2F and increase tolerance to anti-oestrogen receptor treatment）
最后作者调查了FOXA1的突变环境（Figure 3h）。整体上有35个病人(9.7%)携带FOXA1突变，9个携带promoter热点突变，13个携带基因突变，14个携带局部扩增。这个图还包含其他信息（主导突变特征，家族病史等等）。
子图i是FOXA1的promoter热点突变的作用机制模型。
Power to discover promoter mutations
找到候选的驱动元件（driver mutation）既需要足够的深度测序覆盖率以检测可靠的突变，又需要足够大的样本群（cohorts）以达到统计显著性（不然样本不能或不足以反映总体情况）。
那么问题来了，promoter区域富含GC，导致很低的测序覆盖率。即使这篇文章研究的探测灵敏度已经非常高了，但是总体上promoter的覆盖率只有44%，那么很可能检测到的突变只是总体突变的一半左右。
之前也有不少关于乳腺癌的全基因组测序，但是都没有发现文章中提到的重要promoter突变。作者分析有两个原因：
- 富含GC的promoter灵敏度太低。像TCGA的包括100个左右样本，50X的标准肿瘤测序深度，总体平均灵敏度为93%，但是FOXA1那里只有1%。
- 样本容量不够，导致功效很低（TCGA 5%的样本中54%，该文章研究10%/20%的样本中69% Figure 4a）
（Figure 4 | Power analysis of ExomePlus patient cohort）
有意思的是，虽然病人携带这些重要promoter突变的比例很难与coding基因的相提并论，但是就单个突变频率来讲，promoter突变足以排进前列（Figure 4b）。原理上讲，低突变率反映了该突变了的作用目标少，没有选择性优势。为了评估作用目标大小的有效性，作者比较了已知为cancer driver的编码区和文章中promoter的可能导致功能改变的事件突变率（$\mu_f$）。除了TP53和PIK3CA，promoter的突变率超过一些已知的coding driver或者与它们相似，表明promoter观察到的低突变率至少部分是由于它们有更小的功能基因组印记。
总结
我对文章的评价——
- 文章核心是找到了有重要生物意义的FOXA1 promoter突变，并进行了系统详细的功能验证。
- 文章亮点在于功效分析和对比分析：解释了为什么重要promoter突变难找；进一步确定了功能调控元件突变的重要性，具有一定的前瞻性。
