二代质控

二代测序中，每测一个碱基会给出一个相应的质量值，这个质量值是衡量测序准确度的。碱基的质量值13，错误率为5%，20的错误率为1%，30的错误率为0.1%。行业中Q20与Q30则表示质量值≧20或30的碱基所占百分比。例如一共测了1G的数据量，其中有0.9G的碱基质量值大于或等于20，那么Q20则为90%。

        Q20值是指的测序过程碱基识别（Base Calling）过程中，对所识别的碱基给出的错误概率。

        质量值是Q20，则错误识别的概率是1%，即错误率1%，或者正确率是99%；

        质量值是Q30，则错误识别的概率是0.1%，即错误率0.1%，或者正确率是99.9%；

        质量值是Q40，则错误识别的概率是0.01%，即错误率0.01%，或者正确率是99.99%；


首先，碱基质量值是衡量测序质量的重要指标，质量值（Q）越高代表碱基被测错的概率（P）越小，其计算公式为Q=-10lgP。例如，Q20和Q30分别代表碱基被测错的概率为1%和1‰。Illumina官方一般以Q30作为评价标准，以目前最常用的HiSeq 2000平台2×100PE测序为例，Illumina官方保证大于80%碱基准确度达Q30，而千年基因在合同中严格保证大于85%碱基准确度达Q30。

总结：

测序时每个碱基都会有质量值，我们设定一个阈值：20或30，如果低于这个阈值就表示碱基基本是测序错误的碱基，对测序的每个碱基做统计，如果

测序时每个碱基都会有质量值，如碱基质量值为20则表示该碱基的错误率为，10^（20/(-10)）=0.01=1%（根据Q=-10lgP计算）

行业中，为了评估下机reads测序的准确度，我们会评估Q20或Q30（及所有碱基质量值大于20或30所占的比例），一般合同中要严格保证Q30至少达到85%。

二代质控：去接头，去Q平均<20；N>2,去PCR重复，去插入序列较短的序列。

3‘端质量会降低----测序酶活降低

5‘端质量不好----测序仪刚运行

二代纠错，kmer(一段重复序列)显示较低质量值，读取数量异常，把异常碱基替换为其它碱基看是否正常，但错误碱基太多则无法纠错。

三代质控

三代指控不同于二代碱基质量标准Q20和Q30，三代由于其随机分布的碱基错误率，其单碱基的准确性不能直接用于衡量数据质量。

三代纠错是用二代辅助（二代短reads比对到三代上，如果某一位点二代测得A，三代测T，三代可能测错了），或者自纠错，

组装算法

基因组组装的基本思路：无论是一代sanger、二代短reads、三代长Pacbio，我们得到的测序数据相较于整个基因组而言仍然是极小的；我们的任务就是将这些小片段连接起来；序列之间的联系因为重复序列的存在变得非常复杂，通过overlap我们最终都会构建Graph，所有的算法都会从Graph中得到最优路径，从而得到最初的contig。

目前，构建Graph的主流方法有3种，Overlap-Layout-Consensus（Celera Assembler、PBcR），de Bruijn Graph（SOAPdenovo ） 和 String Graph（Falcon）。

1 OLC算法(Overlap-Layout-Consensus)

适用于reads读长较大的测序数据，如一代和三代的reads。

主要分为三步：

（1）Overlap：，对所有reads进行两两比对，找到片段间的重叠信息；

（2）Layout：根据得到的重叠信息将存在的重叠片段建立一种组合关系，形成重叠群，即Contig；

（3）根据构成Contig的片段的原始质量数据，在重叠群中寻找一条权重最重的序列路径，并获得与路径对应的序列，即Consensus。

OLC算法最初成功的用于Sange测序数据的组装，比如Celera Assembler，Phrap，Newbler等均采用该算法进行拼接组装。

2 DBG算法(德布莱英图 de Bruijn graph  SOAPdenovo)

适用于reads比较短的测序数据，二代数据。缺点：难以对重复序列区域进行分析，更依赖于建库。

首先将reads打断成长度为K的核酸片段，即Kmer，在利用Kmer间的overlap关系构建DBG，再通过DBG得到基因组序列。

DBG算法最早应用于如细菌类小的基因组的组装上，直到李瑞强等(2010)开发SOAPdenovo 算法，成功的组装了采用二代测序的黄瓜及熊猫的基因组，DBG算法开始普遍运用。

假设我们获得的reads是20bp，图1a中，生成6个片段，每个片段长度（L）是10bp，至少重叠长度（O）为5bp，然后各个片段建立OLC图。图1b的Kmer为5，建立DBG图。

DBG算法相比于OLC的优势是什么？

由于二代测序得到的reads长度较短，包含的信息量较少，因此完成基因组拼接需要较高的覆盖度。OLC算法适用于读长较长的序列组装，通过构成的OLC图寻找Consensus sequence的过程，实际上是哈密顿通路寻找的问题，算法非常复杂。

若采用OLC算法，会大大增加拼接的复杂性以及运算量。而采用DBG算法，通过K-1的overlap关系，构建DBG图，通过寻找欧拉路径得到Contig序列，从算法的角度极大的简化了组装的难度。

注意：N50只是能看出来连续性好坏，不能说组装效果好，contig拼错了scaffold N50也会提高。

SOAPdenovo 软件的组装过程

（1）通过Kmer之间K-1的overlap关系构建contig（重叠群），如图2

实际测序过程中，contig的组装过程要比上图复杂，根据K-mer之间的关系进行连接。

reads（read1：AGATCTTGTTATT；read2：GTTATTGATCTCC）逐bp的打断成长度为5bp的Kmer，根据Kmer间的overlap关系进行连接。可以看到两条reads中 GATCT 和 GTTATT 是两个重复的片段，在构建De Bruijn图中，会形成如上图的泡状结构以及多个分支的情况，面对这种很复杂的图，如何才能找到那一条正确的路径呢？

①对De Bruijn图进行化简

简化De Bruijn图需要去掉无法继续连接的分支、低覆盖度的分支，并且利用序列信息化简重复序列在De Bruijn图的分叉通路，对于少量的杂合位点，采用随机选择策略，合并杂合位点。通常需要考虑如下几种情况：

②得到一个简化的De Bruijn图后，仍然会因有很多分叉位点无法确定真正的连接关系，因此接下来在每个分叉位点将序列截断，得到了最初contigs。

（2）利用pair-end信息，将无overlap关系的contigs搭建成scaffold(脚手架），需要将将测序得到的reads比对回得到的contigs，利用reads之间的连接关系和插入片段大小信息，将contigs组装成scaffolds。，如图3：

（3）补洞

得到的scaffold中间会有较多的gap，为了使组装的序列更完整，需再次利用测序的双末端数据之间的配对关系连接contigs，并利用测序数据与已经组装的contig之间的覆盖关系对contig之间空隙进行补洞，延长contigs，补洞后的contigs长度相比补洞之前一般增加2-7倍。

3 string graph算法

有利于组装散列重复序列。

string graph中的节点是长度不一的序列，这些序列是由overlapping reads生成，需要设置一个最小overlap大小。