导语 Origingene
广东省科学院动物研究所客户在病毒学期刊《Virologica Sinica》上发表了一篇“Pangolin HKU4-related coronaviruses found in greater bamboo bat from southern China”的文章。上海元莘生物有幸承担了病毒组测序相关工作。本研究采集了2016年和2017年期间中国云南省和广东省的20种蝙蝠中729份肛拭子样品，分析了其中α冠状病毒和β冠状病毒的分子特征和遗传多样性。利用高通量测序平台获得了其中来自褐扁颅蝠（Tylonycteris robustula）的2个冠状病毒TyRo-CoV-162275和TyRo-CoV-162269的全长基因组序列，并首次对含furin蛋白酶切割位点的蝙蝠冠状病毒HKU4r-CoV进行了报道。这些发现拓展了我们对冠状病毒地理和宿主分布的理解。
文章信息
研究背景
野生动物携带的人畜共患病毒威胁人类健康，越来越多的证据表明，野生动物是人畜共患病毒外溢的中间宿主。然而，人畜共患病毒从宿主到中间宿主再到人类的传播途径基本上未知。在过去的几十年中，蝙蝠被认为是冠状病毒等各种人畜共患病毒的自然宿主，而直接或间接蔓延到人类社会的蝙蝠传播病毒已造成多次毁灭性疫情。
蝙蝠冠状病毒与引起这些疫情的冠状病毒密切相关，已在中国南方的蝙蝠中被报道，引起了人们对这些热点的关注。中国南方适宜的地理环境和气候条件造就了蝙蝠的丰度，为该地区蝙蝠栖息地的冠状病毒的遗传多样性和进化提供了最大的可能性。中国蝙蝠传播的冠状病毒多样性最高的地区是云南和广东，在本研究中，我们调查了来自云南和广东省份的蝙蝠中的冠状病毒多样性，以丰富我们对冠状病毒在蝙蝠中的分布和进化理解。
材料与方法
1. 样本收集
本研究在云南和广东两地九个不同地区进行采集，每只蝙蝠被捕获后都被保存在一个干净的布袋里。使用肛拭子从单个蝙蝠采集单独的粪便样本。采样后，立即将肛拭子置于预充有1 mL病毒运输介质(VTM)的2 mL试管中，在液氮中快速冷冻，然后在- 80℃下储存直至使用。
2. 蝙蝠种类鉴定与冠状病毒检测
通过分析蝙蝠的外部形态特征和线粒体Cyt-b基因序列(使用蝙蝠的翼膜样本)来鉴定每种蝙蝠。为了检测病毒，将装有肛拭子样本的试管解冻(冰上)，并均质化(2.5 m/s, 1分钟)。通过分析体表形态特征和线粒体结构鉴定各蝙蝠种类Cyt-b基因序列(使用蝙蝠的翼膜样本)。在生物安全柜中使用高纯度病毒RNA试剂盒从样本中提取总RNA。利用RT-PCR检测冠状病毒RNA依赖的RNA聚合酶(RdRp)基因保守片段(440 bp)。
引物分别为:CoV-FWD3(5′-GGTTGGGAYTAYVVHAARTGTGA-3′)、CoV-RVS3(5′-CCATCATCASWYRAATCATCATA-3′)和CoV-FWD4(5′-GAYTAYCCHAARTGTGAYAGAGC -3′)。冠状病毒RdRp序列上传GenBank数据库(登录号:MW600658-MW600715)。如果合并样本的冠状病毒检测结果为阳性，则通过重复上述步骤分别检测单个样本，以验证单个样本的冠状病毒检测结果为阳性。
研究结果
1. 抽样
共采集蝙蝠729只，其中409只来自云南省，320只来自广东省。146种蝙蝠中，2种来自狐蝠科（Eonycteris spelaea，Rousettus leschenaulti)， 1种来自147种天幕巨蝠科(Megaderma lyra)，4种来自蹄蝠科(Aselliscus stoliczkanus，Hipposideros armiger，H.larvatus，H.pomona)，5种来自菊头蝠科(Rhinolophus affinis，R.pearsonii，R.pusillus， R.siamensis，R.sinicus)， 1种来自犬吻蝠科(Tadarida plicata)，7种来自蝙蝠科(Miniopterus pusillus，Myotis chinensis，M.laniger，M.pilosus，Ia io，Tylonycteris pachypus，T.robustula)(表1)。
2. 冠状病毒检测
通过RT-PCR，从9种不同蝙蝠的58份(8.0%)标本中检测到CoV RNA：T.robustula (TyRo, 28.95%)，I.io (IaIo, 16.67%)，M.chinensis (MyCh, 13.33%)，M.pilosus (MyPi 2.17%)，M.laniger (MyLa, 20.00%)，R.sinicus (RhSi, 9.57%)，R.pearsoni(RhPe, 2.43%)，R.affinis (RhAf, 44.83%)，A.stoliczkanus (AsSt, 2.70%) (图1)。在9个采样点，蝙蝠冠状病毒检出率从0.0%到31.1%不等，每个采样点的阳性率从高到低依次为:Jingning (JN, 31.1%)， Maoming (MM, 21.6%)，Menghai (MH, 8.9%)，Conghua (CH, 8.2%)，Lufeng (LF, 6%），Yingde (YD, 3%)。Jinghong (JH), Mengla(ML)和Huidong (HD)的蝙蝠样本中未检出RNA冠状病毒(图1)。蝙蝠群体的阳性检出率为：66.7%（LF，MyPi）、57.7%（JN，RhAf）、50%（JN，MyLa）、50%（MM，RhAf）、35.5%（JN，RhSi）、33.3%（LF，IoIa）、28.9% 163（MH，TyRo）、28.6%（CH，RhAf）、18.2%（YD，MyCh）、4.8%（JN，AsSt）和4.8%（MM，RhPe）(图1)。
3. 基于RdRp片段的地理进化分析
冠状病毒RdRp区是广泛用于鉴定冠状病毒的RNA聚合酶片段。系统进化分析显示RdRp基因部分保守片段(387 bp)的核苷酸序列，38份样本属于αCoV属，20份样本属于βCoV属。所有序列可分为7个进化枝，其中5个属于αCoV属(HKU6r-CoV、Decacovirus、Nyctacovirus、Minuacovirus和Rhinacovirus)，2个进化枝属于βCoV属(Merbecovirus和Sarbecovirus)(图2)。
Rhinacovirus分支(绿色，图2)的冠状病毒分为4个分支，其中物种和各分支间的地理限制特征可区分。分支1的冠状病毒来自Conghua(CH)的R.affinis，分支2和分支3的冠状病毒来自Maoming（MM）的R.affinis，分支4的冠状病毒来自Maoming（MM）的R.pearsonii。我们在M.chinensis分支中检测到一株来自Yingde（YD）的样本的冠状病毒(橙色，图2)。在Nyctacovirus分支中检测到的冠状病毒来自Menghai(MH)的T.robustula，并且与在贵州省发现的T.robustula的HKU33-CoV(紫色，图2)接近。在 Jingning（JN）样本中的有172044条序列与HKU10相关，而在其它分支中检测到的其他冠状病毒与湖北省发现的R.ferrumequinum中检测出的HuB2013相关(暗黄色，图2)。HKU6r-CoV进化枝中检出的冠状病毒具有较差的物种和地理限制，而在M.pilosus、I.io，M.chinensis和 M.laniger中检出的冠状病毒来自LF、Yingde（YD）或Jingning（JN）（浅蓝色，图2）。Sarbecovirus分支在Jingning（JN）的R.sinicus和Maoming（MM）的R.sinicus中检出的冠状病毒与YN的菊头蝠中的SARSr-CoV有亲缘关系(红色，图2)。有趣的是，在MH的 T.robustula中发现的8种冠状病毒与穿山甲中的MjHKU4r-CoV有关，与MERS-CoV、HKU4-CoV和HKU5-CoV一起属于Merbecovirus分支(深蓝色，图2)。
4. 蝙蝠冠状病毒TyRo-CoV-162275和TyRo-CoV- 162269全基因组的系统进化分析
为进一步确认本研究中检测到的Merbecovirus 和Nyctacovirus两个病毒进化支之间的关系，选择来自Merbecovirus分支的HKU4r-CoV相关样本(TyRo-CoV-162275)和Nyctacovirus分支的HKU33r-CoV相关样本(TyRo-CoV-162269)进行全基因组测序。TyRo-CoV-162275具有典型的Merbecovirus基因组结构，包含Merbecovirus亚属中存在的所有10个病毒开放阅读框(ORFs)，相似图分析表明，TyRo-CoV-162275与蝙蝠MjHKU4r-CoVs的基因组核苷酸同源性最高(图3A、C) 。系统发育分析S，ORF1ab，E，M和N基因和全基因组序列进一步证实，在MH的 T.robustula中检测出的TyRo-CoV-162275与在广西穿山甲中检出的P251T和MjHKU4r-CoVs密切相关，而在同一个 T.robustula 种群中检测出的与在贵州T.robustula中检测出的HKU33-CoV密切相关（图3B）。
此外，相似性图分析显示，TyRo-CoV-162269与蝙蝠HKU33的基因组核苷酸同源性最高，重组分析显示TyRo-CoV-162269基因组序列未发生重组事件。在用于CoV物种分类的ORF1ab的5个保守复制酶域中，TyRo-CoV-162275与来自穿山甲的MjHKU4r-CoV的氨基酸同源性为99%，与蝙蝠Tylonycteris冠状病毒HKU4-CoV的同源性为97%，核苷酸同源性分别为96%和90%，表明TyRo-CoV-162275是蝙蝠MjHKU4r-CoV样病毒，属于蝙蝠Tylonycteris冠状病毒HKU4种和Merbecovirus亚属(图3D)。
5. TyRo-CoV-162275的受体使用及S蛋白裂解位点分析
受体结合和S蛋白裂解是阻止Merbecovirus病毒感染人类细胞的两个障碍。MERS-CoV以人二肽基肽酶4 (human dipeptidyl peptiase -4, hDPP4)为进入细胞的受体，其S蛋白被宿主蛋白酶水解，从而介导细胞膜融合，furin蛋白酶可促进这一过程。鉴于MERS-CoV、蝙蝠HKU4-CoV和穿山甲MjHKU4r-CoV使用hDPP4作为进入细胞的受体，我们研究了蝙蝠TyRo-CoV-162275是否也使用hDPP4进入细胞。
TyRo-CoV-162275、HKU4-CoV、HKU5-CoV、MERS-CoV和MjHKU4r-CoVs的核苷酸和氨基酸系统发育树表明，TyRo-CoV-162275与穿山甲MjHKU4r-CoVs的关系比与蝙蝠HKU4-CoV的关系更近(图4A和B)。MERS-CoV S蛋白的受体结合基序(RBM)中有16个关键残基，决定了其与hDPP4的结合。Bat TyRo-CoV-162275共享这16个关键残基中的7个，提示它可能也使用hDPP4作为进入细胞的受体。相比而言，以hDPP4为受体的穿山甲MjHKU4r-CoVs和蝙蝠HKU4-CoV在16个残基中分别与MERS-CoV共享8个和7个，而HKU5-CoV仅共享1个残基，但未与hDPP4结合(图4D)。TyRo-CoV-162275共享16个关键残基中的10个，提示其也可能使用穿山甲DPP4作为细胞进入受体(图4D)。
此外，我们在蝙蝠TyRo-CoV-162275基因组的S蛋白亚结构域1 (SD1)中预测了一个潜在的furin蛋白酶裂解位点(RQQR)，该位点与MERS-CoV和pangolin 229 MjHKU4r-CoV基因组相似(图4C和D)。考虑到在230个公开的蝙蝠HKU4r-CoV基因组中没有发现这样的裂解位点，这是首次报道蝙蝠HKU4r-CoV含有furin蛋白酶裂解位点。
研究总结
综上所述，本研究的研究结果表明，蝙蝠冠状病毒在中国南方、云南和广东的多样性和生态复杂性高于之前的估计。研究还发现了穿山甲HKU4相关冠状病毒在T. robustula含有一个furin蛋白酶裂解位点。我们应该对蝙蝠冠状病毒进行进一步研究和特征分析，以进一步了解它们的宿主范围和中国和东南亚蝙蝠种群的进化史。
参考文献
Guo M, Zhao K, Peng X, et al. Pangolin HKU4-related coronaviruses found in greater bamboo bat from southern China[J]. Virologica Sinica, 2023.
