Strep-tag系统因其与Strep-Tactin®之间的高亲和力（Twin-Strep-tag®可达pM级别）和高特异性结合，已成为蛋白质纯化和PPI研究非常好用的工具。本文旨在为研究者提供一份详尽的strep pull down实验指南，此前我们了解了strep标签的插入及稳转细胞系的构建，我们接着学习！
三、Strep Pull Down实验操作与相互作用蛋白的捕获
核心目标
利用前一阶段构建并验证合格的、稳定表达Strep标签融合蛋白的细胞系，通过Strep-tag亲和纯化技术，特异性地捕获作为“诱饵”（Bait）的Strep标签融合蛋白，并同时“钓取”与之在细胞内发生相互作用的“猎物”（Prey）蛋白，形成蛋白质复合物。这些复合物将用于后续的质谱分析，以鉴定未知的相互作用蛋白。
主要技术原理
Strep Pull Down的原理基于Strep-tag II或Twin-Strep-tag®与固定化Strep-Tactin®之间的高度特异性和高亲和力结合。Strep-Tactin®是经过基因工程改造的链霉亲和素，通常偶联在琼脂糖凝胶（如Sepharose®、Superflow®）或磁珠等固相载体上。当含有Strep标签融合蛋白的细胞裂解液与Strep-Tactin®磁珠孵育时，标签蛋白会结合到磁珠上。经过一系列温和的洗涤步骤以去除背景中非特异性结合的蛋白质后，可直接将磁珠交付质谱公司进行质谱兼容性洗脱及质谱分析。(Nature Protocols, 2007; The Strep-tag system for one-step purification)。
实验步骤与操作流程
❶ 细胞培养与裂解：
●大规模培养已验证的稳定表达Strep标签融合蛋白的细胞系。细胞数量通常需要达到10^7至10^9级别，具体取决于目标蛋白的丰度和相互作用的强度。
●收集细胞：通过胰酶消化（贴壁细胞）或离心（悬浮细胞）收集细胞，用预冷的磷酸盐缓冲盐溶液（PBS）洗涤细胞2-3次以去除培养基残留。
●细胞裂解：加入温和的细胞裂解液。裂解液的组分对维持蛋白质相互作用至关重要，通常包含：
◆缓冲体系：如Tris-HCl或HEPES，pH 7.4-8.0。
◆盐离子：如100-150 mM NaCl，维持生理渗透压。
◆非离子去污剂：如0.1-0.5% NP-40 (Igepal CA-630) 或 Triton X-100，以裂解细胞膜并释放蛋白，同时尽量不破坏蛋白质复合物。
◆抑制剂：务必新鲜添加蛋白酶抑制剂混合物（如cOmplete™ Protease Inhibitor Cocktail）和磷酸酶抑制剂混合物（如PhosSTOP™），以防止目标蛋白和相互作用蛋白降解或去磷酸化。
在冰上进行裂解（如用移液器轻柔吹打、Dounce匀浆器温和匀浆，或超声处理但需严格控制功率和时间以避免蛋白变性）。详细的哺乳动物细胞裂解方案可参考Methods in Enzymology, 2015; Strep-Tagged Protein Purification。
◆收集上清：将细胞裂解物在4°C下高速离心（如14,000 xg，15-30分钟）以去除细胞碎片和未裂解的细胞核，取上清液即为细胞总蛋白提取物。
❷ Strep-Tactin®树脂的准备与平衡：
●根据树脂供应商的说明书操作。通常取适量的Strep-Tactin®琼脂糖珠或磁珠悬液（优选磁珠），用裂解液（不含蛋白酶/磷酸酶抑制剂，以避免抑制剂与树脂作用）或特制的结合缓冲液洗涤2-3次，以去除储存液并使树脂达到与细胞裂解液相同的缓冲环境。
●Strep-Tactin XT针对Twin-Strep-tag具有更高的亲和力和特异性，可应用于低表达量蛋白的亲和富集。
●Strep-Tactin®磁珠可选择：Strep-Tactin®Sepharose®, Strep-Tactin®Superflow®(琼脂糖珠) 或Strep-Tactin®Magnetic Beads (磁珠)。品牌如IBA Lifesciences, Qiagen, GE Healthcare (Cytiva)等。
❸ 孵育结合：
●将制备好的细胞裂解液上清与已平衡的Strep-Tactin®磁珠混合。在4°C条件下，使用旋转混合仪或摇床进行轻柔孵育，时间通常为1-4小时，有时也可过夜孵育以确保充分结合。孵育时间需根据目标蛋白与标签的亲和力以及相互作用的稳定性进行优化。
●在加入磁珠前，务必取少量细胞裂解液（约占总体积的1-5%）作为Input对照，用于后续Western Blot分析，以确认Strep标签融合蛋白在裂解液中的表达情况。
❹ 洗涤：
●孵育结束后，通过低速离心（琼脂糖珠）或磁力架（磁珠）收集结合了蛋白质的磁珠。弃去未结合的上清液。
●用预冷的洗涤缓冲液洗涤磁珠。洗涤缓冲液的组分通常与裂解液一致即可。
●重复洗涤3-5次，最后使用PBS清洗3遍以去除去污剂成分，每次洗涤后都需彻底去除洗涤液。
●关键点：传统的质谱鉴定模式下，洗涤步骤是降低背景噪音、提高信噪比的核心环节，其条件（洗涤次数、缓冲液组分、洗涤液体积）需要仔细优化。基于严格对照的定量筛选模式下，非特异性吸附可以高效的被排除，可以选择弱清洗以保留更多弱相互作用。
❺ 洗脱：
●用于质谱分析的部分磁珠不用洗脱可直接寄送，可以避免溶剂替换、胶回收等额外的实验操作，保证实验流程的简洁以减少数据损失和失真。
●基于WB和考/银染评估的部分磁珠，可使用含有竞争性洗脱剂Desthiobiotin的loading buffer进行洗脱。Desthiobiotin的常用浓度为2.5-5 mM。
❻ 实验评估：
●Pull Down产物（洗脱液）可以直接进行SDS-PAGE电泳分离，并使用WB和考染评估Pull down实验的特异性和富集效率。
●进行Western Blot分析，使用抗Strep-tag抗体或Bait蛋白抗体，验证Bait蛋白是否成功捕获和洗脱。
●通过银染或考马斯亮蓝染色可以初步观察pull down实验的富集效率，特别是是否有Bait蛋白条带以及潜在的Prey蛋白条带。
实验设置与对照
严格的对照是Pull Down实验成败的关键，将用于筛选区分特异性相互作用和非特异性背景。
阴性对照 (Negative Controls)：
●载体对照/亲本细胞对照：使用转染了空载体（不含Strep-tag）的细胞裂解液，或直接使用未经基因编辑的亲本细胞裂解液，进行与实验组完全相同的Pull Down流程。此对照能鉴定那些与Strep-Tactin®树脂本身非特异性结合的蛋白质。
●无关标签蛋白对照 (Optional but Recommended)：使用表达一个与当前研究目标蛋白功能无关的Strep标签蛋白的细胞系进行Pull Down。此对照有助于排除由Strep-tag本身可能介导的一些非特异性相互作用。
Input对照 (Input Control)：
取少量（通常1-5%）进行Pull Down之前的细胞总裂解液。通过Western Blot检测Input中的Strep标签融合蛋白，可以确认Bait蛋白在实验起始时的表达情况，并作为后续Pull Down效率的参考。
生物学重复 (Biological Replicates)：
进行至少三次独立的生物学重复实验（即从三次独立培养的细胞开始，分别进行裂解、Pull Down和后续分析）。这对于后续质谱数据的统计学分析、筛选高可信度的相互作用蛋白至关重要。
注意事项与优化策略
●裂解条件的温和性：在保证细胞充分裂解的前提下，尽量选择温和的裂解条件（如较低浓度的非离子去污剂，避免剧烈机械操作），以最大限度地保护蛋白质复合物的完整性。所有操作均应在4°C或冰上进行，且抑制剂必须新鲜添加。
●避免生物素污染：细胞培养基中可能含有痕量或较高浓度的生物素，它会与Strep-Tactin®发生极高亲和力的结合，从而竞争性抑制Strep-tag蛋白的结合。如果怀疑存在生物素污染，可以考虑在细胞裂解液中加入过量的Avidin或Streptavidin预处理，以封闭游离的生物素，然后再进行与Strep-Tactin®树脂的孵育。具体操作可参考 IBA Lifesciences Strep-Tactin Purification Protocol (关于生物素的部分)。
●实验一致性：为保障筛选的准确性，Pull down实验组和阴性对照之间，除细胞外应保持全程的实验一致性（细胞量、实验体积、试剂成分、磁珠量等）。
●质谱兼容性：洗脱液的组分应与后续的LC-MS/MS分析兼容。例如，离子型去污剂（如：SDS）、溴酚蓝、甘油等会干扰质谱分析。如果洗脱液组分不兼容，可能需要在酶解前进行样品清理（如透析、沉淀纯化、SPE小柱脱盐等），推荐以磁珠形式送测。
关键要点
Strep Pull Down的核心在于利用Strep-tag与Strep-Tactin®的高亲和力特异性结合，通过温和的裂解、严格优化的洗涤和高效的Desthiobiotin洗脱，捕获Bait蛋白及其相互作用复合物。严格的阴性对照和生物学重复是确保结果可靠性的前提。特别注意避免生物素污染和蛋白质降解。
小结
由于完整的Strep Pulldown实验指南篇幅过长，我打算分多篇文章发布，接下来我将讨论pulldown实验的常见问题及其排除方法。欢迎持续关注！
谱度众合专门开发了Strep Pulldown蛋白互作研究解决方案，为客户提供从细胞构建培养、亲和富集实验到质谱高通量筛选的一站式服务（阶段可选）。如果您觉得Strep Pulldown实验繁琐、不确定性强，或是周期紧张，您可以交由谱度众合来完成。
谱度众合是一家由武汉大学博士团队创办的科研服务企业，我们专注于利用质谱技术服务于生物标志物、药物靶点筛选、基础研究等蛋白质研究领域，我们在本专业细分领域持续深耕十几年，针对具体研究场景开发多种面向具体研究目的和论文发表需求的服务产品，助力于客户更轻松更高效的完成科研目标。
