细胞培养基本操作

笔者最近在培养人脐静脉血管内皮细胞(Human Umbilical Vein Endothelial Cells,HUVEC),记录一下细胞培养的一些基本操作。

细胞传代:

从37°C含5%CO2的培养箱中拿出细胞培养瓶,首先观察培养瓶内的液体是否混浊(混浊说明细胞可能被污染),然后镜下观察细胞生长情况,当细胞长满70%以上时,可以传代。

25ml培养瓶内加入3ml PBS清洗两次,之后加入0.5ml胰酶(实验室用的仙人掌胰酶比较温和),放入培养箱消化3-5min(要确保细胞被消化下来),加入2ml培养基(ECM)终止消化。将液体收集到离心管,350g 离心5min(这样才能沉淀细胞),之后去上清,向离心管加入6ml ECM,吹匀细胞(吹成单个细胞),向三个25ml培养瓶分别加2ml,之后在向培养瓶内补培养基到6ml

细胞冻存:

25ml培养瓶内的细胞长满后,用3ml PBS清洗两次,胰酶消化离心之后,弃上清,加入4.5ml培养基和500μl DMSO (10%),吹匀细胞后分装到5个冻存管,每个1ml,放入-80冻存。

细胞复苏:

冻存的细胞从-80或者液氮拿出来后,立即放到37°C的温水中(注意冻存管内是否漏入液氮),融化之后,350g 离心5min,弃上清,加入1ml ECM,吹匀细胞,加入25ml培养瓶,并补齐ECM到6ml。


注意:

一.培养瓶在盖盖子时要过酒精灯,并且培养瓶的盖子不能拧紧;

二.75ml培养瓶是10ml培养体系,加1.5ml胰酶消化,加4倍量培养基终止消化;6孔板是2.5ml培养体系(0.3ml胰酶消化),12孔板是2ml培养体系(0.1ml胰酶消化),24孔板是1ml培养体系(0.1ml胰酶消化),96孔板是100μl培养体系(1滴胰酶消化)。加完胰酶要轻微晃动培养瓶或培养板,使胰酶能够覆盖贴壁细胞;

三.清洗所用的PBS的量,是培养基量的一半;

四.25ml培养瓶长满细胞大约有5\times 10^6个细胞;

五.HUVEC传到第4代后就不能用了。

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