Q16: 哪些物质会影响CCK8的测定？

A16: 当有还原性物质存在时会影响CCK-8的测定，例如含有维生素C的Glucose等 (一般培养基中的量不多，酚红或血清不影响测定)。在有酚红存在的情况下，会增加空白吸收，但不影响测定，扣除空白吸收即可。

Q17: 在实验中吸光度值太高，如果不能减少细胞数量，如何解决？

A17: 可以缩短加入CCK-8后的培养时间。例如: 可以把加入CCK-8试剂后的培养时间由2小时缩短为1小时。

Q18: 设定参比波长的目的是什么？必须设定吗？

A18: 不一定要设定。CCK-8试剂在参比波长没有吸光度。设定参比波长的目的是为了取出由于样品混浊所带来的吸收。

Q19: 说明书上仅写了96孔板的测定方法.如果使用24孔板或12孔板，应该加多少量CC K-8试剂？

A19:  一般情况下建议加入CCK-8试剂的量是培养基体积的1/10.

Q20:  在CCK-8显色过程中，如何终止反应？

A20:  有以下几种方法（96孔板）：①在显色反应后，将培养板放置4℃冰箱内。②每孔加10μl 0.1 MHCL溶液。③每孔加10μl的 1%（w/v）的SDS（十二烷基硫酸钠）溶液。注意：反应停止后，应在24小时之内测定。

Q21:  必须预培养细胞吗？

A21: 不一定。如果要向保持细胞的最好状态，建议预培养细胞。如果不做细胞预培养 ，细胞内的脱氢酶可能会不稳定。也有人不做细胞预培养，但在做标准曲线和检测时需要统一检测条件。

Q22:  如果加入的药物中含有金属，是否会有影响？

A22: 金属对CCK-8显色有影响。当终浓度为1 Mm的氯化亚铅、氯化铁、硫酸铜会抑制5%、15%、90%的显色反应，使灵敏度降级。如果终浓度是10 Mm的话，将会100%抑制。

Q23: CCK-8试剂的保存条件？

A23:在避光条件下CCK-8试剂在4℃可保存一年。如果需要保存较长时间的话，推荐在-20℃下保存。但是CCK-8若反复解冻和冰冻将会增加空白吸收，从而影响检测结果，若经常使用可将试剂存放在4℃冰箱内保存。

Q24:  预培养后，更换培养基需要细胞计数吗？

A24: 一般情况下用胰蛋白酶处理对数增长期的细胞，用血球计数盘计数，制备成一定浓度的细胞悬液即可。如果想要精密计数细胞的话，可以预培养后取培养基用血球计数盘进行计数。

Q25:  CCK-8对于不同的细胞，灵敏度是否一样？

A25: 不一样，悬浮细胞与贴壁细胞相比较难染色。对于贴壁细胞，一般加入CCK-8培养1-4小时吸光度已经很高，但对于悬浮细胞则可能吸光度较低，可以通过延长CCK-8的加入时间或增加细胞数量来解决。

Q26:悬浮细胞和贴壁细胞在数量上有何区别？

A26:悬浮细胞由于染色比较困那，一般需要增加细胞数量和延长培养时间。贴壁细胞染色比较容易，若细胞数量过大，有时吸光度会超过酶标仪的读数。

Q27:  应该每次做标准曲线吗？

A27: 建议每次做。虽然细胞是一样的，但是细胞的状态不一定一样，对于状态不一样的细胞，建议每次做标准曲线。如果试剂的批号不一样，灵敏度可能会有轻微的差异，对于不同的批号建议分别做标准曲线。

Q28: 有时在药物作用情况下，细胞已经死亡，但是脱氢酶的活性还在，是否能计算细胞数量？

A28: 不能。由于CCK-8是通过和细胞内的脱氢酶进行反应间接反映活细胞数量，如果细胞已经死亡，但脱氢酶的活性还在，则试剂测定的细胞数量将会比真实值高，不能真实反映活细胞数量，建议采用别的方法测定。

Q29: 实验之前，是否需要先检测一下培养基和CCK-8是否会反应？

A29: 需要，可用一个孔检测一下，因为有培养基中可能含有氧化还原反应的物质，在正式实验之前有必要先确认培养基和CCK-8是否反应。一般正常在的OD值应该在0.4以下。

Q30:  如果OD值太低，可以采取什么办法？

A30:  可以采取2个办法：① 适当增加细胞数量。② 延长加入CCK-8试剂后的染色时间。