引言

在植物分子生物学中，蛋白质互作是细胞生命活动的核心，但在面对植物坚硬细胞壁、液泡释放的蛋白酶与次生代谢物，以及弱瞬时的核心调控互作时，传统方法往往力不从心。

邻近标记（PL）技术从“捕获”转向“记录”，利用基因工程改造的混杂性酶，在活细胞原位将小分子标签共价连接到邻近蛋白，即便后续裂解条件剧烈，标签也不会消失，能高效富集鉴定诱饵蛋白的邻近分子。

今天我们就通过拆解12个植物学里程碑式文献，复盘PL技术从「BioID的水稻破冰」到「TurboID革新植物免疫研究」的演进脉络，解析不同生物学问题下的技术取舍与优化策略，为植物科研工作者提供全景式实战指南。

研究动态、瞬时、弱相互作用的最佳工具—PL-MS蛋白邻近表达筛选解决方案⬅️⬅️⬅️

基于TurboID/miniTurbo邻近标记技术联合质谱，推出植物专属 PL-MS 蛋白邻近表达筛选解决方案，为客户提供从植物细胞构建培养、亲和富集实验到质谱高通量筛选的一站式服务（阶段可选）：①植物目标序列获取和特异性质粒克隆构建、②植物基因编辑和稳定 / 瞬时细胞系构建（适配拟南芥 / 烟草等模式植物）、③植物细胞 / 组织培养和邻近标记（支持生物素浸泡 / 真空渗透处理）、④生物素标记蛋白的亲和纯化富集（链霉亲和素强结合）、⑤植物蛋白提取和酶解、⑥质谱检测、⑦植物蛋白数据分析和互作网络构建。

▶弱/动态 / 瞬时互作：依托TurboID/miniTurbo核心技术，在植物体内原位捕获低丰度转录因子（如 FAMA）的弱相互作用和瞬时互作蛋白，突破传统 AP-MS 局限；

▶高亲和性：链霉亲和素亲和效价强，无需严格非变性条件，高效捕获植物膜蛋白、核骨架蛋白等难溶蛋白的互作信息；

▶避免阴性结果：基于质谱定量数据进行无偏见高通量筛选，针对植物稀有细胞类型（如气孔保卫细胞）也能获得丰富互作信息，告别“假阴性”；

▶精准筛选：结合植物蛋白功能注释、稀有细胞特异性定量差异、互作网络核心节点等多维度分析，提供植物候选邻近表达蛋白清单；

▶原位精准表达：在植物目的基因N/C端原位插入标记酶，还原植物生理状态下的蛋白互作网络，贴合真实发育调控场景。

01 技术全景：植物邻近标记工具箱的底层原理与参数解析

PL 技术主要分为三大类，核心特性如下：

▶ 生物素连接酶家族：BioID、BioID2、TurboID/miniTurbo、AirID。

▶ 过氧化物酶家族：以APEX2 为代表。

▶ 新兴系统：PUP-IT（分枝杆菌来源，非生物素体系）、Split-PL（拆分酶片段，仅邻近时重组活性，适配膜接触位点与特定蛋白互作验证）。

表1：主流植物邻近标记酶核心特性对比

02 案例拆解与适配逻辑：12个植物PL研究场景的深度复盘

[起步期] 水稻OsFD2转录因子 —— BioID在植物中的“破冰”与温度悖论

▶ 研究背景：2017年以前，PL技术主要局限于动物细胞。Lin等人致力于解析水稻中调节开花和发育的关键转录因子OsFD2的互作网络，但转录因子的互作往往瞬时且发生在复杂的核环境中，传统Y2H难以模拟核内真实环境 。

▶ 适配困境：TurboID未问世，BioID的最适温度（37°C）远高于水稻原生质体的生理温度（25-28°C），且细菌 BirA 基因在植物中可能存在隐秘的内含子剪接位点，导致蛋白表达失败。

▶ 破局策略：① 优化BirA * 基因（去除隐秘剪接位点）；② 在25-28°C下进行了长达24小时甚至更久的生物素孵育；③ 添加高浓度生物素。

▶ 结果：鉴定出14-3-3 蛋白等互作因子，实现植物PL技术从0到1的突破。

[膜蛋白] 病原效应子 AvrPto 与 HopF2—— 攻克膜蛋白互作难题

▶ 研究背景：植物病原细菌通过III型分泌系统向植物细胞注入效应子来抑制免疫：

▶ AvrPto: 定位于质膜，干扰受体激酶信号。

▶ HopF2 : 一种效应子，但存在膜定位和细胞质定位的争议。

▶ 技术痛点：膜蛋白具有疏水性，而Co-IP实验中必须使用去垢剂，导致膜蛋白溶解不彻底，大量沉淀；或者去垢剂太强导致互作复合体解散。

▶ 适配逻辑：PL 共价标记允许强去垢剂裂解，兼顾膜蛋白溶解与标记稳定性。

▶ 结果：Conlan 等人用AvrPto-BioID捕获到APK1、TOM1 等新靶点；Khan 等通过HopF2-BioID明确其膜与细胞质双重定位。

[革命性突破] 烟草N受体与UBR7 —— TurboID 捕捉瞬时免疫复合体

▶ 研究背景：烟草花叶病毒（TMV）抗性蛋白N受体低表达、互作瞬时（识别病毒后数分钟构象改变并降解），BioID 的18小时标记窗口无法捕捉。

▶ 破局策略：引入TurboID，室温下标记信号远超 BioID/BioID2，压缩标记时间。

▶ 结果：发现E3泛素连接酶UBR7，其静息时降解N受体防自身免疫，病毒入侵时解离激活免疫。

【里程碑意义】这是TurboID在植物中的首个重大应用。它不仅发现了一个关键的免疫负调控因子，更重要的是证明了TurboID能够捕捉到E3泛素连接酶与其底物之间这种典型的“瞬时、酶促”相互作用。

[稀有细胞] 拟南芥FAMA转录因子 —— 组织特异性与低丰度蛋白适配

▶ 研究背景：FAMA是拟南芥气孔发育的关键转录因子，仅在气孔保卫细胞前体中低表达，全植株蛋白提取会掩盖其信号。

▶ 适配逻辑：用FAMA内源启动子驱动TurboID-FAMA，仅在目标细胞标记，局部高效催化富集信号。

▶ 结果：成功鉴定多个新互作因子，还绘制了气孔保卫细胞特异性核蛋白组图谱。

[细胞器互作] 植物内质网-线粒体接触位点 —— Split-PL的空间精细化解析

▶ 研究背景：细胞器通过膜接触位点进行物质交换。例如，内质网与线粒体之间的MAMs。这些接触位点没有膜包裹，只是两个膜靠得很近（10-30 nm），传统的离心分级分离法根本无法将其提纯。

▶ 适配逻辑：将TurboID一分为二（N端片段和C端片段），将N端融合到内质网外膜蛋白，C端融合到线粒体外膜蛋白。仅接触时重组，恢复生物素连接酶活性，进而特异性标记接触面蛋白。

▶ 结果：Kwak等人和Cho等人利用此策略，在活细胞中绘制了内质网-线粒体接触位点的蛋白组图谱，鉴定了多种新型的拴系蛋白和脂质转运蛋白。

[特殊化学] 植物纤维素合酶复合体—— PUP-IT规避生物素干扰

▶ 研究背景：解析纤维素合酶复合体（CSC）互作时，植物（尤其是拟南芥）的内源生物素化蛋白干扰质谱检测，掩盖低丰度的CSC互作蛋白。

▶ 适配逻辑：PUP-IT利用细菌类泛素化系统，不依赖生物素，植物内源无干扰。

▶ 结果：无背景干扰，鉴定出互作因子BEN1，揭示其调控 CSC 囊泡运输维持细胞壁合成的机制。

[核孔复合体] 植物核膜蛋白降解机制—— BioID2的亚细胞结构适配优势

▶ 研究背景：Gu团队关注植物核膜（NE）及核孔复合体（NPC）的组成，这是一个相对静态但结构庞大的复合物。同时，他们也关注核膜内侧蛋白的降解机制。

▶ 策略：为什么不用TurboID？

1. 在需长期积累信号以覆盖低周转率结构蛋白中，BioID2分子量极小（23 kDa），对核孔蛋白这种精密组装结构的立体阻碍最小。

2. 对于这种“慢过程”（结构蛋白的周转），TurboID的高活性可能导致局部生物素迅速耗尽或产生非特异性标记，而BioID2温和、长时间的标记反而能获得更均一的覆盖度。

▶ 结果：鉴定核孔复合体新组分及关键E3 连接酶复合体，证明“慢标记”适配结构生物学研究。

[激酶底物] 油菜内酯BIN2与BZR1 —— 捕捉磷酸化修饰瞬态

▶ 研究背景：油菜素内酯（BR）通路中BIN2对BZR1的磷酸化互作极快（毫秒-秒级），磷酸化后迅速解离，Co-IP无法检测。

▶ 适配策略：用TurboID快速动力学“瞬时标记”底物。

▶ 结果：BIN2-TurboID特异性标记BZR1，同源激酶AtSK41无此效果，为激酶谱研究提供范式。

[病毒互作] TMV复制酶与 ATG8 —— BioID适配植物病毒聚集体研究

▶ 研究背景：病毒侵染植物后诱导细胞形成病毒复制工厂，并利用宿主的自噬系统辅助自身复制或逃避免疫。TMV 复制酶后期形成高丰度聚集体，需富集长期招募的宿主因子。

▶ 适配逻辑：通常认为病毒复制快，应该用TurboID。但病毒复制后期，复制酶在胞内聚集，丰度极高。如果使用TurboID，可能会导致局部生物素瞬间耗竭，或者产生大量的非特异性“旁观者”标记。BioID慢动力学更可控，主要富集那些长期被招募到病毒工厂中的宿主因子。

▶ 结果：成功发现伴侣蛋白NbHYPK是ATG8的新互作伙伴，揭示病毒招募宿主蛋白维持复制酶稳定性的机制。

[未来工具] AirID与MiniTurbo —— 低毒性与高效率的平衡

▶ 研究背景：TurboID 长时程标记（如根系发育）导致生物素耗竭，引发植物毒性表型。

▶ 选择策略：AirID低毒、生物素消耗少，适配长时程实验；miniTurbo体积小、稳定性高，适配构象敏感蛋白。

03 超越蛋白：邻近标记在植物核酸互作中的拓展

PL 技术已拓展至核酸互作研究：

▶ APEX-Seq/Halo-Seq 标记特定区域 RNA，解析 RNA 亚细胞定位；

▶ CasID 通过 dCas9 引导酶到基因组特定位点，鉴定 DNA 结合蛋白；

▶ RaPID 招募酶到特定 RNA，研究 lncRNA 结合蛋白，为植物核酸互作研究提供新路径。

结语

从BioID 的艰难破冰到 TurboID、PUP-IT、Split-PL 的精准适配，PL 技术彻底改变了植物互作组学研究的“盲人摸象”局面，照亮了瞬时互作、膜蛋白互作、稀有细胞互作等传统技术盲区。

其演进核心是对植物生物学特性的深度适配—— 常温需求催生 TurboID，背景干扰推动 PUP-IT，空间解析孕育 Split-PL。对于植物科研工作者而言，掌握PL技术的适配逻辑，是解锁高维生物学研究的关键，无论聚焦信号转导、结构合成还是逆境响应，都能找到精准的技术工具，点亮未知的科学版图。

参考文献

1. Yang X, Wen Z, Zhang D, et al. Proximity labeling: an emerging tool for probing in planta molecular interactions. Plant Commun. 2020;2(2):100137. Published 2020 Dec 15.

2. Xu SL, Shrestha R, Karunadasa SS, et al. Proximity Labeling in Plants. Annu Rev Plant Biol. 2023;74:285-312.

3. Conlan B, Stoll T, Gorman JJ, et al. Development of a Rapid in planta BioID System as a Probe for Plasma Membrane-Associated Immunity Proteins. Front Plant Sci. 2018;9:1882. Published 2018 Dec 18.

4. Schaack GA, Sullivan OM, Mehle A. Identifying Protein-Protein Interactions by Proximity Biotinylation with AirID and splitAirID. Curr Protoc. 2023;3(3):e702.

5. Kim TW, Park CH, Hsu CC, et al. Mapping the signaling network of BIN2 kinase using TurboID-mediated biotin labeling and phosphoproteomics. Plant Cell. 2023;35(3):975-993.

6. Kim HB, Kim KE. Precision proteomics with TurboID: mapping the suborganelle landscape. Korean J Physiol Pharmacol. 2024;28(6):495-501.

7. Mair A, Xu SL, Branon TC, Ting AY, et al. Proximity labeling of protein complexes and cell-type-specific organellar proteomes in Arabidopsis enabled by TurboID. Elife. 2019;8:e47864. Published 2019 Sep 19.

8. Lu M, Wei W. Proximity labeling to detect RNA-protein interactions in live cells. FEBS Open Bio. 2019;9(11):1860-1868.

9. Zheng S, Noack LC, Khammy O, et al. Pupylation-based proximity labeling reveals regulatory factors in cellulose biosynthesis in Arabidopsis. Nat Commun. 2025;16(1):872. Published 2025 Jan 20.

10. Lin Q, Zhou Z, Luo W, et al. Screening of Proximal and Interacting Proteins in Rice Protoplasts by Proximity-Dependent Biotinylation. Front Plant Sci. 2017;8:749. Published 2017 May 12.

11. Hurley B, Lee D, Mott A, et al. The Pseudomonas syringae type III effector HopF2 suppresses Arabidopsis stomatal immunity. PLoS One. 2014;9(12):e114921. Published 2014 Dec 11.

12. Li Y, Zhang Y, Dinesh-Kumar SP. TurboID-Based Proximity Labeling: A Method to Decipher Protein-Protein Interactions in Plants. Methods Mol Biol. 2024;2724:257-272.

13. Feng L, Zhou J, Zhu D, et al. TurboID-based proximity labeling accelerates discovery of neighboring proteins in plants. Trends Plant Sci. 2024;29(3):383-384.

14. Zhang Y, Song G, Lal NK, et al. TurboID-based proximity labeling reveals that UBR7 is a regulator of N NLR immune receptor-mediated immunity. Nat Commun. 2019;10(1):3252. Published 2019 Jul 19.