1. Author
夏宁邵是中国著名的生物医学专家，主要从事疫苗和诊断试剂的研发工作。他是厦门大学公共卫生学院的教授，并担任国家传染病诊断试剂与疫苗工程技术研究中心的主任。夏宁邵教授在疫苗研发领域取得了多项重要成果，特别是在乙肝疫苗、宫颈癌疫苗（HPV疫苗）以及新型冠状病毒（SARS-CoV-2）的诊断试剂和疫苗研发方面做出了突出贡献。
夏宁邵教授的研究团队成功研发了全球首个戊型肝炎疫苗（益可宁），并在HPV疫苗的国产化方面取得了重要突破，推动了中国自主创新疫苗的发展。他的工作不仅提升了中国在疫苗和诊断试剂领域的国际地位，也为全球公共卫生事业作出了重要贡献。
2. Background
2.1 内质网应激（Endoplasmic Reticulum Stress, ER Stress）
内质网应激是指细胞内的内质网（ER）功能发生紊乱，导致未折叠或错误折叠蛋白质在内质网腔内异常积累的一种细胞应激状态。
当细胞受到各种内外因素刺激时，内质网稳态被破坏，导致其功能受损，主要表现为：
未折叠/错误折叠蛋白积累： 这是ER应激的核心特征。原因包括：蛋白质合成需求激增（如分泌细胞大量分泌蛋白时）、蛋白质折叠能力下降（如缺氧、营养物质缺乏、钙离子稳态失衡、氧化应激、某些毒素或药物作用）、内质网内环境改变（如pH变化、氧化还原状态改变）、基因突变导致蛋白质本身难以正确折叠。
钙离子稳态失衡： 内质网是主要的钙库，钙离子浓度变化影响许多伴侣蛋白的活性。
氧化还原状态失衡： 内质网是氧化环境，对二硫键形成至关重要，氧化应激会干扰蛋白质折叠。
脂质代谢紊乱： 脂质合成异常或饱和脂肪酸积累也会诱发ER应激。
如果ER应激过于严重或持续时间过长，超出了细胞的代偿能力，会转而激活凋亡程序，清除功能严重受损的细胞。这是防止损伤扩散的重要机制。神经退行性疾病、糖尿病、心血管疾病、癌症、炎症性疾病、肝病等）发生发展的核心病理机制之一。
2.2 羧基荧光素琥珀酰亚胺酯(CFSE)
CFSE检测细胞增殖的原理 核心在于利用荧光染料的可逆性稀释来追踪细胞分裂的世代数。CFSE是一种非极性、膜通透性的荧光染料（通常发出绿色荧光）。当将CFSE加入细胞悬液时，它能被动扩散穿过细胞膜进入活细胞胞质。在胞质内，CFSE的琥珀酰亚胺酯基团与细胞内的游离氨基（主要存在于赖氨酸残基和其他胞内蛋白上）发生不可逆的共价结合反应。这一步将荧光染料永久性地“锚定”在细胞内。
2.3 乙肝病毒抗原
3. Methods
名为E6F6-B的小鼠模型经工程改造可以特异性表达识别HBsAg的B细胞受体（BCR）。该模型作为一个有价值的工具，用于研究连续抗原刺激下接种疫苗后个体体液免疫的动态变化。利用这样一套免疫学工具，作者阐明了HBV携带小鼠接种疫苗后的HBeAg特异性B细胞的分化轨迹。
4. Results
4.1 E6F6抗体的敲入小鼠构建与病原特异性B细胞的研究
基于先前的研究，将E6F6的整个κ链和重链可变区的序列敲入C57BL/6小鼠的受精卵母细胞中，替换内源性重链等位基因J1-J4。该小鼠所得B细胞表达由E6F6可变区和内源性类别转换恒定区。在后续的流式结果表明，该基因小鼠现出约40%的HBsAg结合效率，并用于后续实验。为了评估治疗疫苗给药后E6F6-B细胞的反应，将E6F6-B细胞转移到C57BL/B6小鼠中，随后用CRT3-SEQ13对此进行了免疫。在CRT3-SEQ13疫苗接种后WT小鼠中观察到E6F6-B细胞的明显激活和增殖。 在持续的抗原刺激下，B细胞呈现出减弱的迹象。E6F6-B细胞在GC内进行了增殖，标志着显着的Ki67表达。为了研究治疗性疫苗接种后周围HBSAG的潜在免疫抑制作用，BCR测序表明E6F6B的体细胞超数被抑制，这表明E6F6-B细胞在长期感染的小鼠中的亲和力成熟较少。
4.2 慢性感染中抗体分泌细胞数量呈下降趋势
过量的外围HBsAg会影响抗原特异性B细胞的早期激活； 但是，持续的抗原刺激对疫苗诱导的体液反应的分化轨迹的影响研究仍然较少。实验团队根据文献所展示的Timeline进行了细胞回输、疫苗注射。发现外周抗原在0-34天呈现一个下降的事态，但是随后逐渐回升。这样的现象在临床病人的身上得到了复现。除此以外，WT小鼠抗体与病原的变化与AAV-HBS模型有着明显的变化，为了进一步研究变化的情况，作者对治疗性疫苗接种慢性HBV感染期间GC反应的进行了动力学研究。对于生发中心的B细胞而言，WT小鼠的细胞峰值出现在第六天，而HBV感染模型的小鼠E6F6细胞峰值出现在第13天。同样的趋势同样存在于浆细胞中。但是值得一提的是，HBV感染模型浆细胞在第20天几乎检测不到。
实验团队还发现在存在持续的抗原刺激的情况下，发现在第6天和第20天，TFH细胞的数量显着降低为了研究额外的TFH帮助是否可以在CRT3-SEQ13-OT II免疫后帮助E6F6-B细胞执行功能。结果显示，在TFH的帮助下虽然滴度会略高，但是下降的幅度会高于未帮助组，回弹以后趋于同一水平，为此得出结论：仅额外的T细胞帮助不足以减轻慢性感染期间抗体的减少。
4.3 慢性HBV感染期间E6F6-B细胞体液反应的转录谱
为了从机制层面研究这种抗原持续存在对特异性B细胞的影响，对来自AAV-HBV和WT小鼠的iLN的E6F6-B细胞上进行bulk RNA测序。主成分分析表明，第13天来自AAV-HBV小鼠的E6F6-B细胞的转录组谱图与较早时间点的细胞存在显著差异。对13天的样品进行通路富集分析，发现富集了内质网（ER）应激，细胞凋亡和BCR信号与基因表达相关的基因。为了确定在持续性抗原刺激过程中E6F6-B细胞不同转录组谱的关键因素，在所有时间点都在所有时间点评估AAV-HBV和WT小鼠之间重叠的差异基因。发现主要与蛋白质加工，凋亡，浆细胞分化有关。那么我们自然想到持续的内质网压力可能是抗体迅速降低的关键因素，实验团队评估了凋亡标记，该标记证实了它们在慢性感染过程中在E6F6-B细胞中的表达升高。为了精确到具体哪些细胞亚群经历了内质网应激，实验团队首先将动物模型精确到特异性表达HBsAg的小鼠——ALB-sHBs小鼠。ALB体内的抗原滴度是AAV-HBV 100倍。接下来，进行了对B细胞反应治疗疫苗接种作用的动力学研究。 GC反应在第13天达到峰值，随后PC急剧下降，这与在AAV-HBV小鼠中观察到的相似。值得强调的是，在Alb模型中，PC的数量和频率都明显低于第13天的WT小鼠。
4.4 非典型PC前分化细胞依赖于持续的HBsAg刺激
对注射疫苗第13天的Alb-Shbs和WT小鼠的E6F6B细胞进行了单细胞RNA-Seq。分为了13个亚群。其中，21.84％边缘区B细胞（MZB），63.88％的naïve B细胞和10.21％naive/active的B细胞，这些B细胞分别以CR2，CD79A和FCMR的表达为特征。共有的细胞群包括Pre-GC，DZ-GC和LZ-GC B细胞，PC和记忆B细胞（MBC）。而在持续刺激的Alb-Shbs体内存在着一群clust11——Atypical Pre PC（CD138 BCMA缺失，BLIMP-1 XBP1高表达）。对比WT小鼠与ALB-sHBs小鼠的ASC，实验团队发现，在WT小鼠中的传统PC富集，而在ALB-sHBs小鼠中Atypical Pre PC富集。通过分化轨迹分析，表明这群Atypical Pre PC可能是通过GC_LZ/G1_C1。
结合之前所提到的内质网应激与Atypical Pre PC同时存在与乙肝病原持续刺激的机体内，那么我自然想去探究二者潜在的联系，对其进行通路富集分析发现ALB-sHBs小鼠E6F6 B细胞富集了内质网应激 抗原提呈以及凋亡相关基因。同时，他们实验室用了自己构建的平台评估了抗体分泌情况，发现在慢性感染的模型中，抗体分泌也是显著减少的。
4.5 联合治疗策略可以部分克服PC分化的异常
为了减轻过量抗原的持续负担，实验团队采取了一种疫苗和抗体联合治疗的策略。先用抗体治疗111天，然后过继转移E6F6 B细胞后免疫疫苗。发现这种办法可以有效的抑制血清中抗原的量。同时在后续的时间点也可以检测到乙肝特异性的抗体。这个提示我们减少外周的乙肝病原刺激，有助于后续的B细胞活化，发挥生物学功能。为了检测这种疫苗和抗体联合治疗的策略的可行性，实验团队收集了13天腹股沟淋巴结的E6F6特异性B细胞，并按照途中时间点分别进行抗体给药，细胞回输以及疫苗注射。在抗体给药阶段，E6F6来源的浆细胞含量是增加的，而Atypical Pre PC减少。 总的来说，Atypical Pre PC的细胞频率与是否注射疫苗呈负相关，简单来越少的Atypical Pre PC，对应了更好的病原清除。
5. Discussion
作者：Ruoyao Qi
通讯作者：Ningshao Xia
单位：State Key Laboratory ofVaccines for Infectious Diseases
年份：2023.3.4
期刊：Journal of Hepatology
科学问题 ：通过开发新型B细胞追踪工具，阐明慢性HBV感染期间HBsAg特异性B细胞的分化轨迹和命运。
讨论：本研究通过一种新开发的HBV抗原特异性BCR基因敲入小鼠模型，描绘了慢性HBV感染过程中抗原特异性B细胞的分化轨迹。值得一提的是，单独de CRT 3-SEQ 13可以诱导E6F6和E6F6样抗体的产生，这表明该治疗性疫苗可以在没有细胞回输的情况下引起E6F6-B细胞的分化。我们的研究结果揭示了一个非典型的前PC位于LZ-GC B细胞和PC的分化轨迹之中。这些具有BCR/CD 40信号传导缺失的非典型前体细胞可能是HBV治疗性疫苗疗效有限的原因。
慢性感染已被证明会损害抗原特异性体液应答，而Tfh细胞缺乏是与这种现象最相关的因素。在肠道沙门氏菌感染中，病原体诱导IL-12产生，并导致Tfh细胞和GC的抑制。在疟疾中，诱导前体Tfh细胞，其表现出低水平的PD-1和CXCR
5表达，Th 1相关标志物（如T-bet和CXCR 3）的表达升高。HIV感染诱导更高频率的PD-L1+ GC B细胞，导致与Tfh细胞上的PD-1结合，随后细胞增殖、活化和IL-21分泌减少。此外，树突细胞早期暴露于I型IFN已显示通过IL-6产生诱导Tfh细胞极化，而晚期暴露于I型IFN在缺乏IL-6产生的情况下促进Th 1细胞分化。相反，我们的研究揭示了典型的Tfh标记基因，如PD 1，CXCR 5和BCL 6，在所有检查的时间点，在健康和慢性感染小鼠之间没有表现出显著差异。有趣的是，Tfh的细胞计数在第13天没有显示出显著差异，这表明Tfh细胞帮助在HBsAg刺激的峰值时可能基本上保持完整。然而，E6 F6-B细胞上不存在CD 40，从而避开了通常由Tfh细胞提供的共刺激信号。从涉及E6F6-B细胞和OT II T细胞的共转实验中获得的结果进一步证实，持续的BCR信号诱导的B细胞功能障碍是本研究中引起体液应答异常的主要因素。
关于B细胞功能障碍，据报道，鼠埃里希体和伯氏疏螺旋体感染导致形成短寿命的ASC。已经显示I型IFN信号传导使naïve B细胞倾向于变成短寿命的ASC，并且已经证明疫苗诱导的Tfh细胞拯救PC形成。此外，诸如淋巴组织结构破坏、和滤泡外抗体产生都被报道与持续感染有关。在这里，我们已经确定了一类新的功能失调的B细胞称为非典型前PC。与典型PC相比，这些细胞经历了无序的分化过程，在接种后的最初一周期间，B细胞活化和GC分化都受到抑制。然而，在接种后第13天，检测到E6 F6 B细胞的大量增殖，我们目前缺乏确切的解释。最初，我们推测疫苗诱导的HBsAg清除是GC增殖延迟的原因。然而，在ALB-sHBs小鼠模型中，其中过量抗原负荷不能通过疫苗接种抑制，GC应答仍在第13天达到其顶点。此外，在非典型前PC中观察到BLIMP-1表达升高，而没有明显的ELL 2表达，这可能有助于ER内的抗体保留。在ALB-sHBs小鼠模型中很少检测到GC的解剖结构，表明可能存在滤泡外GC反应。
我们研究的一个主要局限性是，这种中间状态PC亚群的存在尚未在CHB患者的样本中得到证实。解决这个问题提出了两个解释：首先，在没有接种疫苗的情况下，HBsAg特异性B细胞占人外周血单核细胞中总CD 19+细胞的不到0.1%，因此难以获得足够的B细胞进行全面分析。第二，前PC易于凋亡，表明其检测的时间窗口有限。因此，确认人类样本中存在这种非典型前PC群体将需要在我们的治疗性HBV候选疫苗的临床试验中进行调查。另一个限制是在我们的转移系统中复制HBsAg对幼稚B细胞的影响的挑战。在由CRT
3-SEQ 13引发的体液应答的自然过程中，高亲和力E6 F6抗体表达B细胞在疫苗施用后约6天遇到HBsAg。该时间轴对应于亲和力成熟所需的典型持续时间。因此，高亲和力HBsAg特异性B细胞在接种疫苗后不会长时间暴露于大量HBsAg。HBsAg的长期暴露主要发生在幼稚B细胞中，这是因为该细胞群大约每隔几周就会不断补充。不幸的是，HBsAg对幼稚B细胞的干扰在我们的转移系统中不可行地复制。值得注意的是，在其他基于转移的情况下也会遇到这种限制，例如涉及艾滋病毒、淋巴细胞性脉络膜脑膜炎病毒和流感等病原体的情况。
在慢性HBV感染的个体中，HBsAg特异性CD4+T细胞的存在是罕见的，并且当存在时，它们的功能通常受损。在慢性HBV的背景下，缺陷可能更多地存在于CD40L而不是CD40的领域。在这项研究中，我们通过揭示PC成熟过程中的一个特定亚组（称为“非典型前PC”）扩展了这一理论，该亚组在慢性HBV感染期间治疗性疫苗接种后完全不表达CD40 mRNA。值得注意的是，所采用的模型都没有定量的抗原特异性Tfh应答，需要进一步研究抗原特异性辅助T细胞功能。
此外，从AAV-HBV小鼠模型过渡到ALB-sHBs模型的决定源于两个主要考虑因素。首先，HBeAg和HBX在形成HBV慢性感染的耐受表型中发挥作用是公认的。为了消除这些因素的影响，我们选择了HBsAg表达模型。其次，在ALB-sHBs模型中，非典型前PC群体的显著性在频率和细胞计数方面都更明显。相比之下，在AAVHBV小鼠模型中获得足够数量的细胞用于这些评估显著更具挑战性。值得注意的是，与AAV-HBV模型不同，ALB-sHB小鼠模型代表了HBsAg耐受性模型，因为HBsAg在整个动物发育过程中持续表达。因此，两种模型之间的CD 4 T细胞特异性（分子内）的可用性有根本的不同。
在这项研究中，我们调查了在治疗性疫苗接种过程中的慢性感染的背景下，在时间顺序的方式，这是以前没有报道过的HBsAg特异性B细胞的转录谱。我们的研究结果表明，抗原特异性B细胞具有在B细胞卵泡内建立GC的能力，并在免疫后的初始阶段，在健康和慢性感染小鼠中分化为PC和MBC。尽管如此，非常出乎意料的是，在免疫后，抗原特异性GC和中和抗体的水平从第13天到第20天显著下降。通过RNA测序，我们发现存在一个非典型的前PC的独特转录谱。在慢性感染期间给予治疗性疫苗接种后，抗原特异性B细胞分化为短寿命、易发生增殖、非典型前PC。我们推测，这可能是慢性感染持续存在和未解决状态背后的根本原因，这是正在进行的临床试验中观察到的挑战。为了抵消非典型前PC的形成，我们证明了通过治疗性抗体减少BCR信号传导被证明是重振HBsAg特异性B细胞应答的有效策略。因此，鸡尾酒疗法或策略性设计的疫苗，规避非典型前PC的产生，有希望开辟新的途径，为慢性乙型肝炎感染的管理。
