Ricca’s factors作为电信号的可移动的蛋白质效应因子
木质部传递的里卡因子介导损伤时的电信号
(A)13伤8叶后叶柄典型慢波电位（SWP）
(B)步进切割和电信号检测的实验设计。用完整的植物进行试验，此处仅显示了叶片8（L8）和叶片13（L13）的示意图。表面电极E1和E2用红点表示。叶柄切片图显示中静脉和次生静脉（棕色）；箭头和蓝色阴影表示连续的切割。每隔100毫米切开一次
(C) Step切割野生型（WT）植物的诱导电信号。左，叶柄8上E1的记录，右，叶柄13上E2的记录。虚线之间的区域表示长时间持续时间的去极化。这些不同的符号代表着单独的植物。叶柄需要6 ± 1切割才能启动叶片的SWPs；12 ± 2切割才能切断叶柄（n = 19）
(D)在溶液中切割荧光素（1mgmL�1）和碱性紫素（0.01%，w/v）的实验设计
(E)荧光素钠（NaFluo）在WT植物中的传播。对叶柄13（开圈，50像素）中的两个感兴趣区域（roi）进行荧光分析
(F) NaFluo在叶柄13中的繁殖（n = 8）
(G)WT和glr3.3 glr3.6在叶柄13中的繁殖速度（见黑色；n=9-17）；以及挤压伤叶8后叶柄13中SWPs的繁殖速度（见栗色；n=6-11；ND，未检测到）
(H)NaFluo和荧光素-异硫氰酸酯右旋糖酐（FITC-右旋糖酐）在WT植株远端叶柄13中的繁殖速度（n=9-10）
(I)远端叶片阴影的NaFluo加载的实验设计。用铝箔遮荫叶片13后3h提供NaFluo
(J)NaFluo在遮荫13叶叶柄中的繁殖速度（n = 8）
(K)伤口诱导SWP在远荫叶片中繁殖的实验设计。用铝箔遮蔽叶片13后3h后受伤。(L)SWP在遮荫叶叶柄中的繁殖速度13（n = 12）
(M)基本紫素喂养4h后的横切面。请注意，基本的紫信似乎并没有向下运输到根部。比例尺，100 mm。数据为均值± SD；未配对双尾学生t检验f
(A)叶柄烫伤(A) WT植物后。左，叶柄烫伤后3小时（上）或3天（下）；右，烫伤叶柄的放大图像8（所有鳞条，2 mm)
(B)烫伤后3小时内未损伤的WT叶柄和WT叶柄的代表性横切面。在这两种情况下，均使用8叶叶柄。木质部的导管用橙色的点表示（鳞片条，20毫米）
(C)NaFluo通过WT植物的叶柄繁殖。远端13NaFluo的代表性图像（比例尺，2 mm）。NaFluo的应用浓度为1mgmL�1.
(D) SWPs可以穿过野生型植物的烫伤组织。左，叶柄烫伤、挤压伤的实验设计，以及距13叶尖端5 mm的表面电极（红点）记录SWP；右，挤压伤害叶片8后记录的SWP（n=11-21）
(E)WT植株远端叶片13的切割诱导SWPs。左，叶柄烫伤的实验设计，用刀片切割，用叶柄13上的表面电极（红点）记录SWP；右，切割后记录的SWP（n=11-26）。对于(B)-(E)，植物在烫伤3小时后使用。数据为均值± SD；单向方差分析，然后是Tukey检验。参见图S1。
(A) Ricca检测设置。叶柄烫伤的实验设计，溶液的应用，和电信号检测（红点代表表面电极）
(B)施施用后野生型植株13叶柄的典型SWPs。倒置的黑色三角形表示切割的时间点
(C)新鲜未稀释叶提取物（FLE）和煮沸未稀释叶提取物（BLE）诱导野生型植物的SWPs（平均± SD；n=4-11；未配对双尾学生t检验）。(B)和(C)采用了野生型植物的叶片提取物。
(D)Ricca因子识别程序。LN液氮SN上清液AEX阴离子交换色谱SEC尺寸排除色谱色谱-质谱/质谱液相色谱-串联质谱
(E)从质谱分析中对高活性组分中最高丰度肽的排名。iBAQ，基于强度的绝对量化。值得注意的是，TGG1的肽相对丰度高，TGG2和TGG3的存在显示为蓝色。另请参见图S2和表S1。
（A和B）1mm重组TGG1蛋白在WT植物中诱导的SWPs（n=9-17）。MES，50 mM MES，pH 6.0，Tris为阴性对照。沸腾为5 min。倒置的黑色三角形表示切割的时间点
(C)对WT植物中不同浓度下TGG1活性的剂量响应（n=4-14）。
(D)油菜幼虫摄食诱导电信号检测（红点，表面电极）的实验设计。（E和F）苔藓虫喂养诱导tgg1tgg2SWPs
(E)中括号内的数据表示典型记录/总记录的数量
(G)芸苔属植物摄食13 1 h后，在远端叶片中JAZ10的表达分析（n=4-8）。联合国，未受损的植物
SWPs激活伤口远端叶片中茉莉酸依赖的防御基因表达，茉莉 酸锌域10（JAZ10）基因的表达为这些反应提供了一个标记。6当我 们将昆虫关在第8号叶上时，它们未能强烈激活tgg1 tgg2双突变体 的第13号叶中JAZ10的表达（图4G）
谷氨酸在抑制信号传递
(H)TGG1（1mM）诱导的glr突变体中的SWPs（n=9-23）
(I)=-glu诱导的glr突变体中的swp（n=3-10）。5mMl-谷氨酸应用于50 mM MES中，pH 6.0与Tris
(J)不同基因型的挤压伤害诱导的SWP（n=21-26）。8叶被压伤，记录叶柄13的电信号。在(A)、(B)、(C)和(H)中，TGG1用50 mM MES稀释，pH为6.0，用Tris稀释TGG1。从8号叶片中提取TGG1蛋白或L-Glu，并在13号叶片的叶柄上测量电信号。数据为均值± SD；(B)、(F)和(G)的未配对双尾学生t检验；单向方差分析，然后是Tukey的(H)-(J)的Tukey检验。另请参见图S3、S4、S5和表S2。
(A)筛元件电穿透图（EPG）记录的实验设计。绿色表示蚜虫的电极。来自tgg1 tgg2的(B) EPG记录（平均± SD；n=4-8；未配对的双尾学生t检验）
(C)重组tgg1诱导的表达gcamp3的WT植株的胞质Ca2+瞬变（意味着± SD；n=5-10）。插图，溶液加载的实验设计。在MES缓冲液中加入1 mM重组TGG1蛋白，通过8号叶烫伤的叶柄，分析13号叶片（叶柄和叶层）的GCaMP3荧光。MES，50 mM MES，pH 6.0，Tris为阴性对照
(D)挤压伤及电信号检测（红点、表面电极）的实验设计
由于glr 突变体减弱了外源性TGG1（图4H）或谷氨酸（图4I）诱导的电信号 ，因此这些诱导子触发Ca的能力2，由于glr 突变体减弱了外源性TGG1（图4H）或谷氨酸（图4I）诱导的电信号 ，因此这些诱导子触发Ca的能力2+.3研究了glr3和glr3.6背景下的 瞬态变化。tgg1诱导的胞质钙2+ glr3.6单突变体和glr3.3 glr3.6双 突变体的瞬态现象均消失。在glr3.3植物中，Ca2+瞬态值大大降低 （图S7C)。与丰田等人的一致，1 0 外源谷氨酸馈入叶柄触发了大的 胞质钙2+在WT中增加，而在glr3.3和glr3.6中没有增加。我们发现 谷氨酸诱导的胞质钙2 + 在glr3.3单突变体和glr3中，瞬态现象完全 消失。. 6 3 glr3双突变体。然而，谷氨酸诱导的钙2 + glr3.6单突变 体和WT的瞬变情况相似（图S7D）
这些观察结果进一步得到了Ca2 + 与野生 型相比，tgg1 tgg2植株的瞬变被高度减弱，但没有完全消除
说明了谷氨酸通过诱导glr3.3或者glr3来调控Ca信号
(A)快速中静脉提取和代谢组学分析的程序。UPLC-MS/MS，超高效液相色谱-串联质谱法。中静脉中脂肪族硫代葡萄糖苷中异硫氰酸酯（ITCs）的(B)分析（n=4-5）。联合国，未受伤的植物；W，受伤的植物
(C)用葡萄糖醛苷（10 mM）和/或TGG1溶液（1 mM）切割烫伤叶柄8的实验设计和电信号检测（红点，表面电极）
(D) TGG1和葡萄糖醛酸苷分解产物诱导慢波电位（SWPs；n=8-12）
(E) JAZ10在远端叶片13中的表达分析。葡萄糖素（1 mM）和/或TGG1（1 mM）在50 mM MES中，pH 6.0应用于叶片8；处理后1h取叶片13（n=4）
(F)(F)苔藓虫喂养诱导的myb28 myb29中的SWPs（n=36）。在第8叶上记录了电信号。数据为均值± SD；未配对双尾学生t检验。
相对于WT，硫代葡萄糖苷转运体1,2双突变体（ gtr1 gtr2）24增加了扩张叶片中GSLs的水平。25当gtr1 gtr2受伤 时，它产生了与WT相似的swp
说明了gtr1,2对产物的产生存在有抑制作用
这些观察结果进一步得到了Ca2 + 与野生 型相比，tgg1 tgg2植株的瞬变被高度减弱，但没有完全消除
(A)TGG1-StrepII-93His的应用和叶片取样的实验设计
(B)对TGG1-StrepII-93His的免疫印迹分析
(C)短寿命葡萄糖醛酸分解产物在myb28myb29（n=9-12）中诱导慢波电位（SWPs）。最终浓度为1 mM TGG1、1 mM葡萄糖萘素和0.3mMl-抗坏血酸
(D)TGG介导的苷元（硫代氢邻氨酸-O-磺酸盐）的产生和用2-PDS（2,20-二吡啶基二硫醚）捕获苷元。
(E)用2-PDS（1.5 mM）捕获苷元中间体可以减弱1 mM TGG1在WT植株中诱导的SWPs（n=8-18）
(F) JAZ10在WT植株远端叶片13中的表达。2-PDS（1.5 mM）和/或TGG1（1 mM）在50 mM MES中，pH 6.0和Tris应用于叶片8；叶片13在处理后1h被取样（n=4-8）
(G)导致伤口远端叶片Ca2+瞬变和防御基因激活的电信号模型。itc、异硫氰酸酯。在(C)和(E)中，通过叶柄的烫伤区施用。用表面电极记录了远端叶13个叶柄上的swp。数据为均值± SD；单向方差分析后，(C)采用Tukey检验，(E)和(F)采用非配对双尾学生t检验。
2,2-二吡啶二硫醚（2-PDS）在体外捕获GSL衍生的苷元 ，而不阻断肌氨酸酶活性。26在这里，我们使用2-PDS进行体内化学 捕获。为此，WT植株单独提供TGG1或TGG1和2-PDS。我们发现2-PDS 有效地抑制了长时间的tgg1诱导的表面电位成分（图7E）。此外， 在TGG1的存在下，2-PDS阻断了该蛋白诱导JAZ10表达的能力
我们在此证实了Ricca4假说，即植物中的叶对叶的损伤反应信号需要诱导子通过木质部的运输。此外，我们鉴定了swp诱导的Ricca因子的主要移动成分为硫代葡萄糖苷酶（TGG）蛋白。图7G总结了可能导致SWP传播的事件。破坏拟南芥叶片维管组织的昆虫会导致嵌入韧皮部薄壁组织的特殊粘松香细胞释放tgg。27，28我们的研究结果证实了这些维管固有细胞中存储的tgg在叶-叶电信号和诱导伤口反应胞质Ca2+瞬变中的关键作用。同样在伤口部位，由S细胞29组成的第二个血管独特细胞群在破裂时释放GSLs。从损伤部位释放的tgg立即遇到这些GSLs，因此在受损叶片中开始快速GSL水解。然后，当它们通过血管到达远端叶片时，tgg会遇到更多的脂肪族GSLs池，这些池已知存在于未受损植物的木质部中。tgg从GSLs中分离出糖基，产生硫代氢邻近酸-o-磺酸盐。在伤口远端叶片中，这些反应性苷元是触发SWP的长时间成分、大的胞质Ca2+瞬变和茉莉酸通路信号活性所必需的。我们注意 到葡萄糖醛苷衍生的苷元在水溶液中的半衰期为37 s。2 6 因此，SWP 的长时间成分可能部分由苷元寿命决定。
整个实验框架：作者观察到植物在受到破损之后会存在有物质向内部运输，说明这种像一种感觉被传递了，与膜的去极化有关，用破碎之后的细胞进行荧光素标记，发现荧光素被传递到了植物内部，用质谱的方法发现有个物质在显著增加，并且对应到了基因，发现这个基因会影响另外一个物质的量发生变化对应的物质会被传递到别的细胞中，会引起Ca的流动，前体物质被找到。谷氨酸会对信号传递有影响。
