Treg细胞是肿瘤中主要的免疫抑制细胞，是免疫治疗的潜在靶点。但针对肿瘤浸润（TI）Treg的免疫治疗效果不确切。这篇文章里作者对三例ccRCC患者的外周血和肿瘤中的Treg进行了单细胞测序，鉴定出了不同功能的TI Treg亚群，发现CD177+ TI Treg细胞群可能作为TI Treg特异性免疫治疗靶点。
1. 单细胞测序分析ccRCC病人的TI Treg细胞
作者对13433个外周血细胞和12239个TI细胞进行了测序，从中鉴定出了160个PB Treg和574个TI Treg。作者随后比较了TI versus PB Treg的差异基因，做了火山图（画法见：单细胞亚群差异基因火山图）和top基因的条图。作者还使用了另外一个最近发表的HCC中T细胞的单细胞测序数据集，对PB和TI Treg做了差异分析，得到467差异基因。和前面得到的ccRCC病人的差异基因取交集，得到143个基因。最后作者展示了一些交集差异基因的小提琴图。在这些基因中，CD177在两个癌肿的TI Treg中logFC都是最高的 (ccRCC 4.86, HCC 4.55)。
Treg细胞的marker基因：FOXP3和CD25/IL2RA。参考：T细胞注释
2. The transcriptional bifurcation of TI Treg cells.
作者后面的分析都是把自己测的ccRCC和数据库里下载的HCC的PB和TI Treg细胞在一起分析的。这部分主要是做了monocle2拟时序分析。这个分化轨迹出的挺好的，从PB Treg到TI Treg有明显的分化过程，而且还分了两个Cell Fate。一些在分化晚期阶段表达的基因比如CCR8, CD177, CCL20和CTLA4也是前面鉴定出来的差异基因。两个Cell Fate的细胞存在转录差异。根据差异基因分析，作者鉴定出三个基因表达的distinct trends (d图)，一些基因比如CCR8和CTLA4在两个cell fate中都没有高表达，一些基因比如CD177和TNFRSF4 (OX40)在CF1高表达，而一些基因比如CXCR4和EGR1只在CF2中表达。随后作者对PB, CF1和CF2的细胞做了GSEA，和PB相比，CF1群细胞的naive分数下降，耗竭，细胞毒性和细胞周期评分都增加，和CF1的G2M期细胞比例增加一致。提示CD177+T细胞 (CF1群) 存在增加的clonality。
3. The suppressive TI Treg subset expresses a gene signature with superior prognostic ability
前面的数据显示TI Treg细胞亚群存在转录和功能差异，所以作者想要去探究是否单细胞数据信息可以提供一个具有很好预后提示作用的gene set。作者从TCGA上下载了一个Kidney Renal Clear Cell (KIRC)数据集，这个数据集包括533肿瘤样本和完善的预后信息。作者从KIRC队列随机选了10%的样本进行了特征选择来鉴定gene signature。使用的基因包括：143个ccRCC和HCC共有TI Treg差异基因，86个CF2特异性基因，222个CF1特异性基因。这些基因通过了一个
gene filter，以得到和其他ccRCC中的TI细胞群相比，TI Treg特异性的基因。通过多项式支持向量机，k近邻，boosted tree classifications和bootstrap aggregating classifications supervised machine-learning models ，作者选择了一个线性支持向量机（这个方法过拟合的问题最小）。支持向量机在三个基因集中各挑选出了6个基因（gene signature）。
使用这些gene signature对剩下90%的KIRC样品进行分析，作者发现TI Treg signature和CF1 signature可以很好的对病人预后作区分，CF2 signature则不行 (b图)。而且CF1和TI Treg signature对cox hazard ratio比foxp3更好 (c图)。但是尽管TI Treg 比CF1 signature的hazard ratio更高，CF1 signature在多种肿瘤中对患者预后的预测度都很好，TI Treg signature则相对不好(d e图)。
4. Expression of CD177 is specific to TI-Treg cells in various human solid cancers
CD177是在TI Treg中特异性高表达的 (a-c)，这一点在流式的结果里也得到了验证 (d)。CD177+ Treg细胞占乳腺癌TI Treg的16.8%，占肾癌TI Treg的 16.8%，在T Conv中则表达很少。然后作者想看一下是什么诱导了Treg CD177的体外表达，就做了体外诱导实验，没有诱导出来（这是review要求补的实验吧...）
作者构建了Cd177-KO鼠，发现CD177缺陷的小鼠构建Py8119原位乳腺癌模型和MC38结肠癌模型后肿瘤生长显著下降。CD177的Treg细胞特异性清楚的小鼠，肿瘤体积也要显著减小。
Treg特异性CD177 KO鼠出现了明显的TI Treg数量下降(a)。肿瘤中TI效应T细胞(CD4 Tcov或CD8)/Treg的比例也增加(b)，细胞增殖能力也下降(c)。人类乳腺癌细胞和MC38肿瘤中CD177-和+并没有很明显的趋化因子的变化(d e)，提示CD177可能不是Treg招募进肿瘤的关键调节分子。
5. Expression of CD177 in TI Treg cells leads to an increased suppressive activity
后面验证了一下这群细胞的功能，发现这群细胞对CD4+T细胞有更强的抑制性，给了CD177的抗体移植效应则减轻。
Our study highlights the importance of investigating the heterogeneity of immune cell populations, including Treg cells, in the tumors to improve the understanding of the tumor micro- environment and identify new targets for Treg-based immunotherapy. This data also provides a unique resource of transcriptome data at the single cell level from ccRCC PB and TI immune cells.
