今天分享另外一篇关于大白菜的单细胞文献，做的是seedling，然后加了一个热处理：Single‑celltranscriptomereveals dominant subgenomeexpression andtranscriptional response to heat stress in Chinese cabbage。

文章背景和目的：

大白菜经历了全基因组三倍复制事件，因此有三个亚基因组：least fractioned，小片段亚基因组 (LF)、medium fractioned，中等片段亚基因组 (MF1)和most fractioned，大片段亚基因组 (MF2)。然后，作者指出环境变化影响叶片发育，进而影响产量。为了提高产量和对不同气候的抗性，作者对叶片发育进行全面的研究，包括对细胞类型的异质性和热应激反应的机制研究。

实验设计：

seedling的两个样：shoot（茎尖）和leaf（叶片）。然后叶片进行热处理。总共3个样，每个2个重复，共6个样。

结果：

1. 大白菜茎尖以及叶片单细胞图谱

结果一都是常规的结果，关于图谱的描述。作者对茎尖和叶片分离原生质体，并对其进行单细胞转录组测序。经过质控和过滤共有12985个茎尖细胞和17245个叶片细胞。为了构建白菜叶片发育的细胞图谱，作者将茎尖和叶片细胞合并后进行细胞聚类和注释，总共有28343个细胞被分为19个亚群。在不同cluster的数目组织对比发现，细胞频率分析发现茎尖和叶片样本之间存在差异。

然后作者用了2部分的results来阐述细胞类型注释结果。最终，注释的细胞类型有叶肉细胞、增殖细胞、胚芽细胞、维管束、表皮细胞、保卫细胞，同时在result的第三部分作者还阐述了他们发现了一些白菜叶片细胞类型的新marker基因。

2. 亚基因组优势基因在不同的细胞类型表达

和以往研究的物种，例如拟南芥不同的是，大白菜经历了全基因三倍复制，因此白菜基因组的3个亚基因组在基因密度和基因表达上都存在差异。

所以，作者首先分别统计了3个基因组能覆盖的基因比例（下图a）。

为了鉴定出在特定亚基因组中主要表达的基因，作者分别分析了各个细胞类型中的表达基因的个数和基因表达量等信息。分析结果发现，LF、MF1和MF2中所有表达基因的平均表达量相似（下图c），且显著高于未分组 (UG)中表达的基因。与MF1和MF2相比，LF亚基因组在胚芽细胞和增殖细胞中重点表达（下图b）。

为了鉴定进化上一级基因的加倍情况在单细胞level的影响，作者鉴定了拟南芥和大白菜之间的orthologs，并把这些orthologs分为了几组：one-to-one，one-to-two，one-to-three。然后看下不同类别的基因在不同细胞类型之间的选择情况。然后发现虽然三个亚基因组在不同细胞类型中的表达分布相似，但复制基因的表达模式在不同细胞类型之间存在差异。其中one-two-three占比最多（下图d）。然后作者又查看了这些复制基因在各个细胞类型上的表达值差异，发现表达值在不同细胞类型是有差异选择的（下图e），还举了个AT1G08050的例子，阐述了在大白菜两个ortholog的表达差异情况和细胞类型选择的差异。

然后作者鉴定了在不同细胞类型，来个每个亚基因组特异表达的基因数目（下图f）。从数目可以看出，LF亚基因特异表达或者占主导表达的基因数目是多于MF1/2的，尤其是在增殖细胞上。而MF1是多于MF2的。

3. 热应激诱导的转录变化因细胞类型而异

然后，作者开始查看热处理对于叶片单细胞转录组的影响。

作者对热处理的样本进行scRNA-seq，共获得17245个对照细胞和20663个热处理细胞，聚类为19个亚群，对照组和热处理都包含了这19个细胞亚群，说明细胞类型的一致性不受热处理的影响（下图a），然而每个亚群的细胞占比在两个组之间有显著差异（下图b）。对各个细胞类型的总UMI数进行统计发现叶肉细胞、表皮细胞、保卫细胞和维管束有显著下降，而增殖细胞没有下降。

接着对不同细胞类型在两个比较组之间进行组间差异分析（下图c），结果发现在5种细胞类型中，只有150个公共上调和92个下调的DEGs（下图d），细胞类型特异性DEGs进行GO富集分析，表皮细胞在核糖体、应激调节富集；保卫细胞在蔗糖富集；叶肉细胞和增殖细胞在组蛋白、激酶、细胞和细胞间富集；维管束在运输上富集。

另外，作者还特异比较了热应激过程过程中比较重要的HSP家族在单细胞level的差异（下图d），以及不同member的倾向的细胞类型的差异选择。

和前面分析基因复制事件结果类似，受热应激响应的复制基因也是LF中高于MF1/2（下图f）。

4. 细胞类型特异性热应激反应标记基因

然后，作者单独拿出一个章节去鉴定了细胞类型热处理特异响应的基因集，这基因可以作为不同细胞类型潜在热应激反应标记基因。接着作者每个细胞类型举了2个例子：如BAA03g00780编码金属结合蛋白，在铅暴露、NaCl胁迫和重金属耐受中具有活性，在热处理后的叶肉细胞中上调；BAA03g43520在热处理后的表皮细胞中表达上调；维管束中的BAA07g19420、保卫细胞中的BAA03g14340和增殖细胞中的BAA10g23280，在热处理后的细胞类型中特异性上调或下调。这些功能未知的细胞特异性标记基因需要进一步验证，以探索细胞特异性热反应机制。

5. 热应激导致不同细胞类型的基因表达模式相反

最后作者发现，不同细胞类型在热应激条件下的基因表达模式不同。比如：在叶肉细胞中发现了43个基因，在表皮细胞中发现了140个基因，在保卫细胞中发现了97个基因，在维管束中发现了65个基因，在增殖细胞中发现了54个基因，这些基因在其他细胞类型中显示了相反的表达模式。例如，许多核糖体蛋白家族基因，包括S8e、L2、L22e、L24e和L36e家族成员，在表皮细胞中上调，但在其他细胞类型中下调（下图g）。

这些结果揭示了重复基因表达的差异性，并为研究基因功能多样化提供了新的视角，说明热应激不仅影响细胞类型的特异性基因表达，而且还影响亚基因组的显性。