A novelcolony-print immunoassay reveals differential patterns of distribution andhorizontal transmission of four unrelated mycoviruses in Rosellinia necatrix(Yaegashi etal., 2011)一种新的菌落免疫印迹分析方法揭示了葡萄白纹羽病原菌中四种真菌病毒的分布和水平传播模式

摘要

一种菌落免疫印迹技术（colony-print immunoassay，CPIA）利用anti-dsRNA抗体研究四种白纹羽病菌中的病毒partitivirus (RnPV1)，mycoreovirus(RnMyRV3)，megabirnavirus(RnMBV1),和unidentifiedvirus(RnQV1)在寄主中的分布和水平传播。结果发现RnPV1和RnMBV1均匀分布在单个菌落中，而RnMyRV3在某些菌落扇区中不存在，RnQV1则在扇区之间表现出不同的积累水平。它们在真菌菌丝间的传播速度有差异，并且一种病毒的传播速度会受到菌落中其他现存病毒的影响。真菌-病毒，病毒-病毒之间可能存在多种互作模式。

材料方法

真菌：不含病毒的白纹羽病菌R. necatrix W97菌株+潮霉素抗性基因→RT45-1菌株（不含病毒，抗潮霉素，代号rVF）；W97菌株+plasmid pCPXHYeGFP（可以表达GFP和潮霉素抗性）→RT57-1菌株（不含病毒，抗潮霉素，表达GFP，代号pVF）。并通过菌丝融合的方式让4种病毒分别侵染真菌，并在潮霉素平板筛选，得到系列菌株，如表1。收集菌丝，提取dsRNA，凝胶电泳。

斑点免疫印迹：采用J2单克隆抗体（J2 monoclonal antibody），它是一种抗双链RNA抗体（anti-dsRNA antibody）。这个实验以真菌粗提物，总核苷酸和dsRNA为对象，进行免疫印迹实验，发现三种材料产生的印迹强度没有明显差别，抗体的效率一样。说明在菌落免疫印迹里使用J2单克隆抗体具有可行性。

菌落免疫印迹（CPIA）：文章提到了两个实验，分别用的是针对绿色荧光蛋白的抗体（anti-GFP antibody）和J2单克隆抗体。GFP抗体对rVF和pVF菌株菌落做了印迹实验，发现对比明显，CPIA可行。而用J2单克隆抗体做的就是本文的目的实验，检测病毒的分布和水平传播。

结果

预实验都是成功的：首先材料准备，通过菌丝融合的方法产生了系列真菌菌株都成功转入了报告基因或者病毒。预实验1，GFP抗体对于rVF，pVF菌株菌落的CPIA实验有对比明显的印迹结果，说明CPIA实验可行。预实验2，J2单克隆抗体的效率稳定，不论对象是dsRNA，还是粗提物，可以用于CPIA实验种探测病毒。

病毒在菌落中的分布实验，J2抗体针对系列菌株的CPIA实验表明病毒的分布特点不同，见图1。

病毒水平传播实验，通过有毒有荧光的供体和无毒无荧光的受体菌落共培养，传毒，检测病毒在受体菌落中的传播，见图2（以一种病毒RnPV1为例）。

图1. 荧光场显示了菌落轮廓；第二排CPIA的深色部分表示的是dsRNA（病毒）的分布；而第三排也是CPIA实验，所用探针是针对GFP基因的。

图2. 明场照片显示了供体受体菌落轮廓，测量受体菌落半径，拍照时间以受体菌落半径为主。荧光场显示的是供体菌落轮廓，这主要是为了在CPIA实验里划分供体和受体区域。在CPIA照片中，红色和绿色虚线之间表示受体中的病毒。

参考文献

Yaegashi, H., Sawahata, T., Ito,T., and Kanematsu, S. (2011) A novel colony-print immunoassay reveals differentialpatterns of distribution and horizontal transmission of four unrelatedmycoviruses in Rosellinia necatrix. Virology409: 280-289.