这是一篇详尽的人人都可以做的单细胞实验方法指南，在单细胞测序领域，主流的测序方案均需要昂贵额微流控设备，然而通讯作者Adam Abate教授一篇《Nature Biotechnology》研究彻底打破这一概论。作者研发的 PIP-seq（颗粒模板瞬时分区测序）技术，仅凭涡旋仪等常规设备就能实现高纯度、规模化的单细胞转录组分析，将曾经依赖百万级仪器的实验变为实验室“手搓” 可及的常规操作。
这篇发表于 2023 年 11 月的研究（DOI: 10.1038/s41587-023-01685-z），不仅揭示了颗粒模板乳化的核心原理，更提供了详尽的可复现流程，为单细胞研究的普及奠定了基础。
PART.01：PIP-seq 的核心流程主要分为四步
1、油包水形成
将带条形码的水凝胶颗粒、细胞、裂解试剂与油混合，涡旋1-2 分钟（图 1a，附图1），颗粒自组装成均一液滴，每个液滴就是一个“单细胞反应舱”，无需微流控的精密流速调控。
2、温控裂解与捕获
蛋白酶K在4℃几乎无活性，利用这一特性，将油包水升温至65℃激活蛋白酶 K，细胞裂解释放出 mRNA，被水凝胶颗粒表面的poly (T) 序列捕获（图 1b）。
3、条形码标记
每个颗粒含独特条形码，自动为捕获的 mRNA 打上细胞身份证，后续通过逆转录生成带标记的 cDNA（图 1c-d）。
4、液滴数量规模化生成
兼容96/384/1536 孔板（图 1f），6%的碰撞率（可理解成单细胞油包水），每35 µL条码水凝胶模板可对3500个细胞附加条码，在15mL锥形管中可用2 mL条形码水凝胶模板对22.5万个细胞附加条码(图e)。不论管大小，细胞捕获只需要2 min。在另一篇文献中详细介绍了如何制备带条形码的水凝胶颗粒。
PART.02：制备好水凝胶颗粒后，具体实验怎么做呢？
1、样本与试剂准备
将制备好的单细胞以 300g 离心 5 分钟，用不含钙和镁的 1× 磷酸盐缓冲液（PBS，Thermo Fisher，货号 70011044）搭配 0.04% 牛血清白蛋白（BSA）洗涤两次，通过 70 μm 细胞筛过滤，随后重悬于含 1% 泊洛沙姆 F127（Pluronic F127，Sigma，货号 P2443）的 1× PBS 中。
2、反应体系混合
取 5μl 浓度为 500 个 /μl 的细胞，加入 35μl 含 29 U/ml 蛋白酶 K和 70 mM 二硫苏糖醇的带条形码水凝胶模板中，吹打 10 次混匀。细胞与带条形码水凝胶模板混合时需小心操作，避免产生气泡。
3、乳化处理
向细胞 - 磁珠混合物中加入 280μl 油（Fluent BioSciences，货号 FB0001804），在涡旋仪（Vortex Genie 2，Scientific Industries）上以最大转速水平涡旋 15 秒，随后垂直涡旋 2 分钟。
4、多余油相去除与裂解反应
去除 230μl 多余油相，将乳化液置于 PCR 仪中进行酶解反应：65℃孵育 35 分钟，随后 4℃保温（PCR 仪热盖温度设为 105℃）。
5、破乳与模板洗涤
去除剩余油相，采用以下方法破乳：用多通道移液器向乳化液顶部加入 180μl 室温高盐缓冲液（含 250 mM Tris-HCl（pH 8）、375 mM KCl、15 mM MgCl₂和 50 mM DTT），随后加入 40μl 100% 全氟辛醇（Sigma-Aldrich，货号 370533）。
涡旋 3 秒后短暂离心，去除下层油相，将带条形码水凝胶模板转移至 1.5ml 离心管中，用含 1% 泊洛沙姆 F68（Gibco，货号 24040032）的 2× 逆转录（RT）缓冲液（含 100 mM Tris-HCl（pH 8.3）、150 mM KCl、6 mM MgCl₂和 20 mM DTT）洗涤三次。
6、cDNA 合成
洗涤后离心收集磁珠，去除水相，保留 25μl 磁珠缓冲液混合物。向其中加入 25μl 逆转录 master mix（含 4.8% PEG8000、4% PM400、2.5 μM PIPS_TSO（5’-AAGCAGTGGTATCAACGCAGAGTGAATrGrGrG ）、1 mM dNTPs、1 U/μl RNA 酶抑制剂和 1 U/μl 逆转录酶），充分混匀后进行 cDNA 合成反应：25℃孵育 30 分钟，42℃孵育 90 分钟，85℃孵育 10 分钟，最后 4℃保温。
7、全转录组扩增（WTA）
在逆转录产物中直接加入 50μl 2× KAPA HiFi master mix 和 0.25μM PIPS_WTA 引物（5’-AAGCAGTGGTATCAACGCAGAGT），进行热循环扩增：95℃预变性 3 分钟，随后进行 16 个循环（98℃变性 15 秒、67℃退火 20 秒、68℃延伸 4 分钟），最后 72℃延伸 5 分钟，4℃保温。
8、模板去除与 cDNA 纯化
使用 Corning Spin-X 滤柱（13000g 离心 1 分钟）去除带条形码水凝胶模板。采用 0.6× Ampure XP 磁珠纯化扩增后的 cDNA。
9、文库构建与测序
以 WTA 扩增产物为模板，使用 Nextera XT DNA 文库制备试剂盒、定制 PIPS_P5library 引物和标准 Nextera P7 索引引物构建文库。将文库混合后，在 Illumina NextSeq 2000 测序仪上进行测序，测序时加入 15% PhiX 文库。具体引物序列已列举在原文附表中。
PART.03
手搓的单细胞测序效果究竟如何？
作者分两个层次进行测序方案的性能验证
一、量化交叉污染率
将人 HEK 293T 细胞与小鼠 NIH 3T3 细胞按 1:1 混合，通过 PIP-seq 测序，利用物种特异性转录本区分细胞来源，通过 UMI 分布判断双细胞（doublet）比例。
关键结果：
① 跨物种污染率＜3%：人细胞转录组中小鼠来源读数占比低于 3%，远低于行业 10% 的合格阈值；
② 双细胞率符合泊松分布：仅 6% 的条形码对应多细胞转录本，与理论预期一致（图 2c、d）；
③ 条形码特异性强：磁珠含～10⁸个独特条形码，可支持 100 万个细胞的无重复标记（通过分步池连接 4 个 6bp 随机序列实现）。
二、健康乳腺组织与 10x Genomics 的 “头对头” 对比
同一批乳腺组织样本，同步用 PIP-seq 和 10x Genomics Chromium v3 测序，下采样至相同细胞数（2400 个）和测序深度（36500 reads / 细胞），对比细胞分型、marker 基因及表达相关性。
关键结果：
① 细胞分型完全一致：均识别出管腔上皮细胞（LEP1/2）、肌上皮细胞、成纤维细胞等 7 类细胞（图 3a）；
② marker 基因高度重合：两类技术预测的细胞类型特异性 marker（如肌上皮细胞的 KRT14、内皮细胞的 ANGPT2）表达模式完全匹配（图 3d）；
③ 基因表达相关性极高：聚类水平的表达相关系数 R²＞0.98（图 3e），虽 PIP-seq 单细朐检测基因数略少（ median 1757 vs 10x 的 2298），但核心转录组特征无偏倚（扩展数据图 3d）。
两项实验证明了 PIP-seq 在细胞分型、marker 基因及表达相关性等性能指标上与商业化微滴单细胞系统无明显区别。
PART.04作者进一步在两个方向上展示了具体应用的案例
用于单细胞混合CRISPR筛选的PIP-seq
研究人员利用PIP-seq对经过CRISPR干扰（CRISPRi）文库处理的细胞进行测序，同时捕获了单细胞的转录组信息及其所携带的sgRNA身份。
作者使用了一个预先设计好的CRISPRi等位基因系列库（allelic series library）。该库中的sgRNA针对多个必需基因，并且每个基因都对应一系列具有不同错配位点的sgRNA，这些sgRNA能够产生从高到低不同效率的基因敲低效果（Fig. 4a）。这使得研究人员能够定量地测量基因表达水平与预期敲低效率之间的关系。将稳定表达dCas9-KRAB的K562细胞用上述CRISPRi慢病毒文库进行转换（Fig. 4b）。对转换后的细胞进行PIP-seq单细胞测序。由于sgRNA序列本身也被多聚腺苷酸化，因此它们能与细胞的mRNA一起被微球上的条形码引物捕获并测序（Fig. 4c）。
结果显示PIP-seq成功地对混合细胞群进行了测序，并准确地将sgRNA的身份分配给了成千上万个单个细胞。定量验证基因敲低效果结果显示：对于同一个靶基因，不同敲低效率的sgRNA（按预测效率从高到低排列）所导致的靶基因表达水平呈现出预期的梯度变化趋势。而非靶向的对照sgRNA（图中标注为"Null"）则不会引起特异性变化。这强有力地证明了PIP-seq数据的准确性和敏感性，能够分辨出细微的表型差异（Fig. 4d）。
研究人员重点展示了靶向HSPA5基因的sgRNA所引起的变化。GSEA分析（基因集富集分析）显示，在携带sgHSPA5的细胞中，与内质网应激（ER Stress）和未折叠蛋白反应（Unfolded Protein Response）相关的基因集被显著富集。这完全符合HSPA5（一种重要的内质网 chaperone 蛋白）被敲低后预期的生物学后果，从而验证了PIP-seq在发现基因功能方面的强大能力。
此外作者还在癌症研究领域验证了PIP-seq方案的适用性
MPAL（混合表型急性白血病）复发的转录组特征。
监测癌症对治疗的反应是单细胞测序的一个新兴应用领域。作者验证了两种癌细胞系（H1975和PC9）对表皮生长因子受体（EGFR）酪氨酸激酶抑制剂吉非替尼（Gefitinib）的单细胞转录反应。通过单细胞转录组分析的结果，与已知其在肺腺癌肿瘤生长过程中的调节作用一致（Fig. 5c）。此外， spike-in到敏感细胞背景中的耐药H1975细胞（H1975:PC9 = 1:9）可以仅凭其单细胞表型被检测出来，且频率大致符合预期（4.7%；Fig. 5d）。
接下来 作者又将PIP-seq应用于研究MPAL，以同时表征单细胞基因表达和表面免疫表型。使用PIP-seq，我们对接受化疗的MPAL个体采集的纵向样本进行了抗体衍生标签（ADT）测序（CITE-seq）。PIP-seq证实了这些样本的诊断结果为B/髓系MPAL，并识别出免疫和干细胞标志物的异常表达，这与通过流式细胞术确定的临床免疫表型相匹配（10a）。结果凸显了单细胞技术在研究MPAL肿瘤异质性和对化疗反应方面的价值，有望将此类技术广泛用于监测癌症进展。
