卵巢是女性重要的生殖器官，也是最早表现出衰老迹象的器官之一，通常在35岁左右开始，卵巢衰老（ovarian aging，OA）是导致与年龄相关的不孕问题的重要因素，包括卵泡数量和卵子质量的逐渐下降，对女性生育能力构成威胁。m6A是一种普遍存在的RNA表观遗传修饰，已在多种生理和病理背景下显示出重要作用。m6A与组蛋白修饰之间的调控机制以及m6A在卵巢发育和衰老中的作用尚不清楚。
2024年10月15日，南京医科大学黄伯贤团队以“The N6-methyladenosine landscape of ovarian development and aging highlights the regulation by RNA stability and chromatin state”为题在老年病学高分SCI《Aging Cell》上发表科研成果，研究通过m6A MeRIP-seq等实验揭示卵巢发育和衰老过程中N6-甲基腺苷（m6A）甲基化谱，阐明了m6A修饰在OA进展中的表观遗传调控机制。
标题：The N6-methyladenosine landscape of ovarian development and aging highlights the regulation by RNA stability and chromatin state（卵巢发育和衰老的m6A 甲基化谱揭示RNA稳定性和染色质状态调控）
期刊：Aging Cell
影响因子：8
技术平台：MeRIP-seq等
研究首先通过m6A甲基化测序技术MeRIP-seq揭示了m6A修饰在卵巢衰老（OA）过程中高表达，这与m6A去甲基化酶FTO减少和m6A甲基化酶METTL16过表达相关。接下来，作者利用FTO基因敲除（KO）小鼠模型和KGN细胞系的研究，同样揭示了FTO缺失和METTL16过表达显著增加了m6A修饰水平。这些变化会导致甲基转移酶SUV39H1下调，进而下调H3K9me3表达。SUV39H1和H3K9me3的下调主要激活了LTR7和LTR12，随后激活ERV1，从而导致细胞增殖减少，而OA中的细胞凋亡、细胞衰老标志物和自噬标志物水平显著增加。总之，本研究为m6A在调控DNA表观遗传学中的角色提供了有趣的见解，包括H3K9me3和TEs，以及自噬，从而加速OA。
研究方法：
研究使用了多种技术，包括m6A RNA免疫沉淀测序（MeRIP-seq）、基因敲除（KO）、过表达（OE）和敲低（KD）等方法。
采用m6A RNA免疫沉淀测序（MeRIP-seq）分析10个人卵巢样本的m6A修饰水平。
使用FTO-KO小鼠模型和KGN细胞系来研究FTO缺失和METTL16过表达对m6A水平的影响。
通过western blot、免疫荧光染色、电子显微镜分析等技术来评估卵巢功能和衰老标志物。
结果图形
（1）卵泡发育和OA中m6A转录组范围内的整体差异分析
研究者对10个人类卵巢样本进行了m6A-MeRIP-seq分析，这些样本被分为四个阶段：胎儿期（Fet）、年轻期（Yng）、老年期（Old）和绝经期（Mop）。
图1：在人卵巢不同阶段的转录组m6A的整体差异分析。
(a) 人卵巢动态微观结构和m6A MeRIP-seq测序示意图。
(b) 人卵巢匹配样本间m6A水平的皮尔逊相关热图。
(c) 在人卵巢不同阶段富集的m6A峰值和基因数量。
(d) 在卵巢发育（OD，从胎儿期到年轻期）、卵巢功能下降（OFD，从年轻期到老年期）和卵巢衰老（OA，从老年期到绝经期）期间获得和丢失m6A的基因数量。
(e) 在OD、OFD和OA期间获得和丢失的m6A峰值数量。
(f) OD、OFD和OA期间m6A基因表达水平箱线图。
(g) OD、OFD和OA期间mRNA表达水平的箱线图。
(h) OD、OFD和OA期间重叠的m6A和mRNA水平的系数相关性分析。
(i) OD、OFD和OA阶段差异表达的m6A基因的维恩图（p<0.05）。
(j) OD、OFD和OA阶段比较207个基因的m6A和mRNA水平。
(k) 模糊C均值聚类鉴定了m6A基因的四种不同的时间模式。x轴代表四个阶段，而y轴代表每个阶段的log2转换、标准化强度比率。
（2）在极端卵巢衰老期间，N6-甲基腺苷（m6A）在内源性逆转录病毒（ERVs）上的高富集情况
图2：在四个不同阶段的逆转录病毒RNA的m6A甲基化和转录组分析概况。
(a, b) 在胎儿期（Fet）、年轻期（Yng）、老年期（Old）和绝经期（Mop）中，逆转录病毒RNA的m6A和转录组的表达水平。
(c) 人卵巢匹配样本之间逆转录病毒RNA的m6A水平的皮尔逊相关热图。
(d) 在四个组中，带有m6A修饰的不同类型逆转录病毒RNA的百分比。
(e) 相邻阶段之间带有和不带有m6A修饰的逆转录病毒RNA的维恩图。
(f) 在卵巢发育（OD）、卵巢功能下降（OFD）和卵巢衰老（OA）期间，常见逆转录病毒与m6A和RNA表达水平之间的相关性分析。
(g) 在OD、OFD和OA期间逆转录病毒中m6A和RNA表达水平的箱线图。
(h) 在胎儿期、年轻期、老年期和绝经期中，ERV1、ERVL-MaLR和ERVL的m6A RIP和input信号的平均概况。
（3）FTO基因敲除介导m6A修饰增加，进而影响自噬通量和卵巢衰老（OA）。
图3：FTO基因敲除（FTO-KO）影响卵母细胞（卵泡）发育潜力。
(a–c) 来自FTO-KO和野生型（WT）小鼠的GV期和MII期卵母细胞的数量。
(d)
FTO-KO和WT卵母细胞中γ-H2AX（红色）和FTO（绿色）的染色图像。
(e)
FTO-KO和WT卵母细胞中每个卵母细胞的γ-H2AX焦点数量（***p<0.001）。
(f)
FTO-KO和WT卵母细胞中染色体（红色）和纺锤体（绿色）的染色图像。
(g)
FTO-KO和WT卵母细胞中纺锤体和染色体缺陷的百分比（***p<0.001）。
(h)
FTO-KO和WT小鼠的卵巢大小。
(i)
FTO-KO和WT小鼠卵巢重量与体重的比例（***p<0.001）。
(j)
FTO-KO和WT卵巢的HE染色（比例尺，500微米）。
(k,
l) FTO-KO和WT组中FTO（红色）、VASA（绿色）和GDF9（绿色）的相对荧光素酶活性（***p<0.001）。
（4）FTO基因敲除诱导细胞凋亡并调控逆转录病毒RNA的m6A水平
图4：FTO基因敲除（FTO-KO）介导细胞凋亡并影响逆转录病毒RNA m6A水平。
(a) 六月龄FTO-KO和野生型（WT）小鼠卵巢中总RNA样本的m6A斑点印迹。
(b) FTO-KO和WT小鼠之间m6A修饰基因的维恩图。
(c) FTO-KO组与WT小鼠相比的特异性m6A修饰基因皮尔逊相关性热图。
(d) FTO-KO和WT小鼠中4232个重叠基因在启动子区域的m6A信号强度。
(e) FTO-KO和WT小鼠中4232个重叠基因的mRNA表达水平的箱线图。
(f) 火山图显示FTOKO和WT小鼠中差异表达的m6A基因。x轴代表log2转换的倍数变化，而y轴代表log10标准化的p值。
(g) 312个差异表达的m6A修饰基因的GO分析。
(h, i) 在Wnt和凋亡信号通路中m6A和mRNA水平的皮尔逊相关系数。
(j, k) FTO-KO和WT小鼠中切割Caspase 9和Bad的蛋白表达（*p<0.05, ***p<0.001）。
(l) FTO-KO和WT小鼠中ERV1的m6A RIP和input信号的平均概况。
（5）FTO基因敲除调控卵巢衰老（OA）中的SUV39H1-H3K9me3-ERV轴
图5：FTO基因敲低（FTO-KD）在卵巢衰老期间影响了SUV39H1-H3K9me3-ERV轴。
(a, b) FTO-KD和空载体（EV）KGN细胞系中FTO蛋白的表达（***p<0.001）。
(c, d) FTO-KD和EV组新合成RNA的荧光素酶强度信号（***p<0.001）。
(e) FTO-KD和EV组中m6A修饰基因的皮尔逊相关性热图。
(f) FTO-KD和EV组中差异表达的m6A基因散点图。
(g) FTO-KD和EV组中差异表达的m6A修饰基因的GO分析。
(h, i) FTO-KD和EV KGN细胞系中H3K9me3蛋白的表达（*p<0.05）。
(j) FTO-KD和EV组中差异TEs上的H3K9me3信号的平均值。
(k) FTO-KD和EV组中增加和减少的TEs上的H3K9me3信号。
(l) FTO-KD和EV组中增加的ERVK、ERV1和ERVL上的H3K9me3信号的平均值。EV，empty
vector。
（6）METTL16过表达在卵巢衰老（OA）中调控SUV39H1-H3K9me3-ERV轴。
图6：METTL16过表达在卵巢衰老中调控SUV39H1-H3K9me3-ERVs轴。
(a, b) M16-OE和EV
KGN细胞系中METTL16蛋白的表达（***p <
0.001）。
(c, d) M16-OE和EV组新合成RNA的荧光素酶强度信号（***p < 0.001）。
(e) M16-OE和EV组中m6A修饰基因的皮尔逊相关性热图。
(f) M16-OE和WT组中差异表达的m6A基因散点图。
(g) M16-OE和EV组中差异表达的m6A修饰基因的GO分析。
(h, i) M16-OE和EV
KGN细胞系中H3K9me3蛋白的表达（**p <
0.01）。
(j) M16-OE和EV组中差异TEs上的H3K9me3信号的平均值。
(k) M16-OE和EV组中增加和减少的TEs上的H3K9me3信号。
(l) M16-OE和EV组中增加的ERVK、ERV1和ERVL上的H3K9me3信号的平均值。
（7）m6A高甲基化诱导ERV1激活，从而导致卵巢衰老（OA）。
图7：由m6A高甲基化诱导的ERV1激活是卵巢衰老的诱导因子。
(a) FTO-KD和M16-OE组中差异表达的m6A修饰基因（p<0.05）的维恩图分析。
(b) FTO-KD组中前三大m6A motif。
(c) FTO-KD和M16-OE组在不同基因组区域共有m6A峰值比例。
(d) M16-OE和FTO-KD细胞系中共有增加的TEs上的H3K9me3信号平均值。
(e) M16-OE和FTO-KD细胞系中共有减少的TEs上的H3K9me3信号平均值。
(f) FTO-KD组中差异表达的TEs的散点图。
(g) FTO-KD组中表达变化的七个ERV1亚家族，其FC>2。
(h,i) sgLTR12和sgLTR7细胞中增殖标记KI67的免疫荧光染色（***p<0.001）。
(j,k) sgLTR12和sgLTR7细胞中衰老标记SA-β-gal的染色结果（***p<0.001）。
(l,m) sgLTR12和sgLTR7细胞中衰老蛋白p21和p53的表达（*p<0.05,
**p<0.01）。
研究局限：
FTO作为一种RNA去甲基化酶，可以去除如N6-甲基腺苷（m6A）、N6-2-O-二甲基腺苷（m6Am）和N1-甲基腺苷（m1A）这样的甲基基团。本研究仅集中研究了FTO通过m6A修饰调控卵巢衰老（OA）的机制。未来的研究可以更深入地探讨FTO如何影响m6Am和m1A修饰，以阐明这一生理过程的多方面特征。
参考文献：
HuX, Lu J, Ding C, Li J, Zou Q, Xia W, Qian C, Li H, Huang B. TheN6-methyladenosine landscape of ovarian development and aging highlights theregulation by RNA stability and chromatin state. Aging Cell. 2024 Oct15:e14376. doi: 10.1111/acel.14376. PubMed PMID: 39410722.
