1.二代测序
2.flow cell（流动池）有8条通道，通道内表面有两种DNA引物与两端接头以共价键连接
1.DNA文库
许多在两头接上了特定DNA接头的DNA片段形成的DNA混合物
- 两端接头为人为加上去的，且序列已知
- 中间的DNA片段序列多种多样，待测序
2.构建DNA文库
- 超声波打断基因组DNA
- 用酶补平两端
- 连接酶连接接头
3. 桥式PCR
- 文库加到芯片上，接头与芯片上的引物共价互补连接
- 加入dNTP和聚合酶，合成新的DNA链
- 加入NaOH碱溶液，DNA双链解链，接头未共价连接的链被冲走
- 加入中性液，DNA片段另一端接头与芯片引物互补连接
-
然后重复上述，DNA成指数扩增
4.把合成的双链变成测序的单链
- 把芯片上的一个引物上的特定基团切掉
- 碱溶液洗芯片，洗掉一条单链
- 加入中性乳液和测序引物
5.测序
-
加入荧光dNTP（3'端被一个叠氮基堵住，保证一个循环只能延长一个碱基）和聚合酶
- 用水把多余的dNTP和聚合酶冲掉
- 显微镜激光扫描，根据荧光判断碱基
- 一轮循环后加入化学试剂切段荧光基团和叠氮基团，从而暴露3'段-OH
- 加入新的dNTP和聚合酶，重复（边测序边合成）
6. 读取index（barcode）
barcode定义：在接头里做特定标记，使每个接头里有一段特定的序列，从而每一个样本都有一个特定的接头，标记样本的来源
- 用碱把上面测序完的链解链，并加入中性液
- 加入barcode引物，进行第二轮测序
- 一般测6-8个碱基就可以知道某段序列来自于哪个样本
7.双端测序（paired-end sequence）
定义：一根DNA链从正向测序一遍，再从负向测序一遍，延长有效测序长度
- 先合成互补链
- 切段原来的模版链
- 加入第二端测序的引物进行测序
