遗传性贫血的临床诊治长期受困于病因不明与治疗手段匮乏——近半数患者无法在已知致病基因中找到突变，而对糖皮质激素无应答或不耐受者更面临无药可用的僵局。传统红系分化模型与免疫-造血交叉调控的割裂认知，使这类疾病的分子病理机制迟迟未被触达。中国医学科学院血液病医院（中国医学科学院血液学研究所）的石莉红、竺晓凡合作团队于2024年7月在《Nature Communications》上发表的研究，依托海星生物（HySigen）构建的 TLR8 点突变细胞株开展功能验证实验，通过对一个四代遗传性贫血家系的系统性追踪，联合全基因组测序与CRISPR/Cas9 基因编辑平台，首次锁定TLR8的功能获得性突变（p.V434L）为该家系的致病根源，并揭示红系细胞内TLR8的异常激活通过干扰ANXA2介导的STAT5质膜定位与磷酸化，从而阻断促红细胞生成素（erythropoietin，EPO）信号、损伤红细胞生成；更重要的是，该研究证实TLR8小分子抑制剂（CUCPT8m）能显著改善先天性纯红细胞再生障碍性贫血（Diamond–Blackfan anemia，DBA）患者来源原代细胞的红系分化缺陷，为糖皮质激素耐药患者提供了“去免疫化”的全新干预策略。这项研究建立的“家系遗传学-类红系功能模型-靶向干预”一体化路径，不仅开辟了遗传性贫血的靶向治疗新方向，也为探索免疫受体在造血谱系中的非经典功能树立了范式。
研究路线与方法
“家系遗传学→功能验证→机制解析→靶向干预”四步走，从临床问题到治疗策略形成完整闭环：
家系遗传学定位：对一个四代遗传性贫血家系进行全基因组测序，锁定X染色体上的TLR8功能获得性突变（p.V434L）
功能验证：利用CRISPR/Cas9构建TLR8突变型细胞系（THP1、HuDEP2、hESC），证实突变增强TLR8对激动剂的敏感性并损害红细胞生成
机制解析：通过免疫共沉淀-质谱联用、免疫荧光和蛋白组分分离，揭示TLR8激活干扰ANXA2介导的STAT5质膜定位与磷酸化，从而阻断EPO信号通路
靶向干预验证：在DBA细胞模型（RPS19⁺/⁻ HuDEP2）及患者来源原代CD34⁺细胞中，证实TLR8小分子抑制剂可有效改善红系分化缺陷并逆转耐药
研究目的与创新点
研究目的：
鉴定该遗传性贫血家系的未知致病基因。
阐明该基因突变损害红细胞生成的分子机制。
探索靶向该基因的潜在治疗策略。
核心创新点：
新基因：首次在遗传性非溶血性贫血中发现TLR8功能获得性突变（p.V434L），拓展了TLR8相关疾病的临床谱系。
新机制：首次揭示TLR8在红系细胞中的非经典功能——通过干扰ANXA2介导的STAT5质膜定位与磷酸化，阻断EPO信号通路，为STAT5调控机制提供了全新维度。
新策略：首次证明TLR8小分子抑制剂能有效改善DBA患者来源细胞的红系分化缺陷，为糖皮质激素耐药患者提供了全新的治疗方向。
核心研究结果
1. 在遗传性贫血家系中鉴定出TLR8功能获得性突变
通过对一个四代遗传性非溶血性贫血家系进行全基因组测序，并遵循X连锁遗传筛选原则，研究团队在X染色体上鉴定出一个全新的TLR8错义突变，先证者为半合子。Sanger测序验证该突与家系疾病表征共分离。结构模拟显示，V434L突变增强了TLR8二聚化界面的疏水相互作用，使其更易被激活。细胞实验验证，TLR8V434L突变体对R848和VTX2337等激动剂的反应性增强，NF-κB活化水平明显高于野生型，表明该突变为功能获得性突变。
图1 1例遗传性非溶血性贫血先证者存在TLR8V434L突变
图2 TLR8V434L错义突变是功能获得性突变，并损害红细胞生成
2. TLR8在红系细胞中表达，其激活从红系祖细胞阶段起损害红细胞生成
TLR8在脐带血CD34+造血干细胞向红系分化的早期阶段（BFU-E和CFU-E）即开始表达，并在后续分化中持续存在。在红系分化过程中，TLR8激动剂VTX2337显著抑制CD71+CD235a+红系细胞生成，诱导细胞凋亡，减少BFU-E和CFU-E集落形成，并导致细胞体积增大；而TLR8抑制剂CUCPT8m则表现相反，显著促进红系分化与增殖。在TLR8V434L突变型hESC来源的红系分化体系及HuDEP2细胞中，突变细胞对VTX2337的敏感性显著增强，更低剂量即可引发表型异常。
图3 早期红系细胞表达TLR8
图4 TLR8激活可从红系祖细胞阶段开始损害红系造血
3.TLR8以红系细胞内在方式调控红细胞生成
通过“诱导者-孵育者”旁分泌排除实验，将经VTX2337/CUCPT8m预处理后的条件培养基转移至未处理细胞，结果未观察到显著的红系分化或集落形成能力改变，排除了TLR8通过微环境旁分泌效应间接影响红系生成的可能性。进一步对FACS分选纯化的CFU-E细胞进行激动剂/抑制剂处理，发现VTX2337直接抑制CFU-E的集落形成和增殖能力，而CUCPT8m则直接促进其增殖与分化；单细胞来源的CFU-E培养实验同样证实TLR8激动剂直接损伤红系祖细胞的克隆扩增能力。以上结果证明，TLR8对红细胞生成的调控是红系细胞内在的，不依赖于免疫微环境。
图5 TLR8通过红系细胞固有方式调节红系造血
4.TLR8激活通过干扰ANXA2介导的STAT5质膜定位与磷酸化，阻断EPO信号通路
TLR8激动剂VTX2337显著抑制红系细胞中STAT5 Y694位点的磷酸化变化（p-STAT5）及其下游靶标BCL-xL的表达，而抑制剂CUCPT8m则增强p-STAT5水平。但STAT5上游激酶JAK2和SRC的磷酸化未发生改变。免疫共沉淀联合质谱分析鉴定出ANXA2为STAT5的关键相互作用蛋白；TLR8激活削弱了ANXA2与STAT5的结合，免疫荧光显示STAT5从细胞质膜弥散分布至细胞质，膜组分中的p-STAT5/STAT5的比例显著下降。敲低ANXA2可模拟TLR8激活对STAT5磷酸化和红系分化的抑制效应，同时CUCPT8m上调p-STAT5的作用在ANXA2敲低后大幅减弱；敲除TLR8则完全消除了CUCPT8m对p-STAT5的增强作用。上述结果表明，TLR8通过破坏ANXA2介导的STAT5质膜锚定，选择性干扰EPO-STAT5信号轴。
图6 TLR8通过干扰ANXA2介导的质膜定位和STAT5的激活而损害红细胞生成
5.TLR8抑制改善DBA模型及患者来源细胞的红细胞生成
在RSP19杂合敲除的HuDEP细胞（DBA细胞模型）中，CUCPT8m显著提高CD235a表达水平、增加细胞总数，并恢复p-STAT5水平。在来源于RSP19突变型DBA患者（对糖皮质激素无应答）的骨髓CD34+原代细胞中，CUCPT8m连续处理显著提升了红系分化效率（CD71+CD235a+比例）；在来源于RPL5突变型DBA患者的原代细胞中，CUCPT8m和另一种TLR8抑制剂CUCPT9a均显著促进了细胞累积增殖。综上，TLR8抑制在多种DBA遗传背景下均能有效改善红系分化缺陷，提示TLR8是DBA等遗传性贫血的潜在治疗靶点。
图7 TLR8抑制可提高来自健康供者和DBA患者的细胞系和原代细胞产生的红系细胞的数量和分化
研究总结
本研究首次揭示TLR8是遗传性贫血的一个新致病基因，并阐明了红系细胞内TLR8的激活通过干扰ANXA2-STAT5信号轴，破坏EPO信号通路，从而损害红细胞生成。更重要的是，抑制TLR8能有效改善DBA患者来源的细胞的红细胞生成障碍，提示TLR8是一个极具潜力的治疗靶点。
图8 本研究示意图
海星生物（HySigen）凭借其在基因编辑领域的深厚积累，高效完成了TLR8点突变细胞株的构建，为石莉红和竺晓凡合作团队提供了TLR8V434L突变型THP-1细胞。这一高质量的细胞模型，为团队得以在等基因背景下精准评估V434L突变对TLR8功能的影响，证实了突变细胞对TLR8激动剂VTX2337的超敏反应，为后续在红系细胞中验证该突变的致病效应奠定了坚实基础。
技术服务：CRISPR/Cas9细胞基因编辑、CRISPR文库筛选/文库病毒/载体构建、分子诊断参考品/突变基因参考品/融合基因参考品、细胞稳转 / 细胞干扰
细胞试剂：HyCyte®干细胞/原代细胞/细胞株、三系诱导培养试剂、细胞专用培养基、基因编辑试剂盒、病毒现货、预筛选胎牛血清
