前言：
挑选到满意的sgRNA之后，就要开始正式实验，而正式实验中细胞转染部分我则不会再讲，直接到最关键的部分：挑取单克隆。
实验正文
1. 实验准备
常规试剂、仪器：转染试剂，流式分选，双抗，Incucyte
2. 实验步骤--将sgRNA插入pSpCas9质粒中
（1）Day 0: 质粒转染
还是同之前一样，将sgRNA-pSpCas9质粒转入到目的细胞中，此时根据可根据细胞不同，选用不同的转染试剂或转染方法。
（2）Day 2/3: 筛选
根据使用的Cas9骨架质粒的不同，筛选的方式也不同：
（1）带抗生素抗性基因的使用抗生素进行筛选；
（2）带荧光标签的细胞则可使用流式筛选：
在这里我选择方法（2）
（1）事先告知流式分选工作人员细胞类型、细胞大小、荧光类型等信息，以便提前调试仪器；
（2）首先将细胞消化为单细胞状态；
（3）使用带双抗的培养基吹打混匀，过了40/70 μm筛后立刻放置于冰上；以相同的手法，准备一管未转染的细胞为阴性对照；
（4）筛选后的细胞立刻置于冰上运输回细胞房；
（5）根据细胞的活力不同，对于皮实的细胞，可直接跳到下一步操作；对于人胚胎干细胞之类的较弱细胞，则需要种在24，12或者6孔板中扩增后，再进行下一步，用这种方法，在筛选后第二天仍可观察到荧光。
（3）挑取单克隆
筛选过后的细胞则按照1个/孔的密度种到96孔板中，放在Incucyte之类活细胞工作站监控，每天拍2-3张全孔扫描照片，7天后查看96孔板单克隆生长状况，反查第1天时的照片，确认是单细胞即可。以下是Incucyte的结果示例（因为连续视频有点大，因此放上day1和day10的图）：
（4）Day 10（根据不同的细胞，选择不同培养时间）
将挑中的单克隆消化后接种到24孔板中扩大培养等待后续验证。
（5）没有可全孔扫描拍照的仪器怎么办
Incucyte是挑单克隆的利器，可全孔扫描的仪器也可使用，由于可以追踪到最早期的细胞个数，因此能确认细胞克隆是来自于单细胞。但Incucyte之类的仪器并不是所有平台都有，此时只能用老方法进行单克隆细胞挑取：
（1）找一个细菌接种环，将荧光细胞圈住，只消化这一颗细胞，之后种到96孔板中（难度很大）；
（2）将细胞消化后，经由流式筛选，使用无限稀释法，稀释获取单细胞（很费96孔板，工作量很大）；
（3）将细胞消化后，在荧光显微镜下，使用枪头吸取荧光细胞，种到96孔板中（难度仍然大，但是可操作性强）；这个方法需要实验室拥有在超净台中的荧光显微镜。
试过之后，觉得方法（3）容易实现一些，可如下图所示：
（1）将显微镜灭菌；
（2）挑取绿色荧光细胞一个，挪到旁边的空白孔种放出，确认为单个后再吸起放入96孔板中；
对于转染难度低且皮实的细胞来说，挑取单克隆可以说是在我这个CRISPR-Cas9敲除方案中最难的一个实验，非常之关键。
