Mol Cancer|肿瘤外泌体和自然杀伤细胞功能障碍：生物学作用、临床意义和免疫治疗意义

原创 huacishu 图灵基因 2022-01-29 09:04

收录于话题#前沿分子生物学机制

撰文：huacishu

IF=27.404

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亮点：

1、作者综述了TDEs在肿瘤诱导NK细胞损伤中的作用及其机制；

2、作者还讨论了TDEs在肿瘤免疫治疗中消除NK细胞作用的临床意义和潜在途径。

伊朗伊斯法罕医科大学医学院Reza Hosseini教授课题组在国际知名期刊Mol Cancer在线发表题为“Cancer exosomes and natural killer cells dysfunction: biological roles, clinical signifcance and implications for immunotherapy”的论文。肿瘤源性外泌体（TDE）在肿瘤生物学的几个方面都发挥着关键作用。现在很明显，TDEs也通过抑制抗肿瘤免疫而有利于肿瘤生长。自然杀伤细胞（naturalkiller，NK）作为免疫监视系统的重要前哨细胞，可以在不需要额外激活的情况下，很早就识别出恶性细胞，从而对抗肿瘤的发展和转移。基于这一原理，体外扩增NK细胞/NK细胞系（如NK-92细胞）的过继转移引起了极大的关注，并作为一种癌症治疗免疫疗法被广泛研究。然而，通过利用各种策略，包括分泌外泌体，癌细胞能够破坏NK细胞的反应。本文综述了TDEs在肿瘤诱导NK细胞损伤中的作用及其机制。本文还讨论了TDEs在肿瘤免疫治疗中消除NK细胞作用的临床意义和潜在途径。

肿瘤源性外泌体（TDE）可通过质膜融合、内吞作用、吞噬作用、微胞饮作用和脂筏介导的内化作用被各种细胞（优先是免疫细胞）摄取。肿瘤外泌体与免疫细胞的摄取/相互作用被认为参与免疫抑制和肿瘤逃逸。有多种证据表明，肿瘤外泌体可通过与细胞膜融合将其货物输送至NK细胞，阻碍其抗肿瘤功能。研究表明，来自胰腺癌细胞（L3.6pl）和小鼠乳腺癌细胞（TS/A）的外泌体被NK细胞吸收并稳定存在于细胞质中，这是其细胞毒性活性降低的原因。口腔癌来源的外泌体和从白血病细胞系（Jurkat细胞）获得的外泌体也被NK和NK-92MI细胞内化。体内实验还表明，来源于胃癌细胞系（MKN-45、MKN-28和SGC-7901）的外泌体主要被NK细胞和巨噬细胞吸收，从而促进胃癌细胞的肺转移。相应的结果表明，外泌体配体与其NK细胞上同源受体的相互作用可诱导多种下游抑制性信号通路，抑制其抗肿瘤活性（图1）。少量证据表明，TDEs能积极影响肿瘤和免疫细胞的募集和迁移，从而建立肿瘤微环境和转移生态位。先前的研究表明，肿瘤外泌体介导MDSCs的迁移，并以CCL2依赖的方式促进小鼠乳腺癌细胞（4T1细胞）向肺的转移。与这些发现类似，最近的一项研究表明，从AML患者中分离的外泌体可以显著减少NK-92细胞向肿瘤细胞的迁移。进一步的蛋白质组分析显示，与从健康供体获得的外泌体相比，AML外泌体在CXCL4、CXCL7和CCL5（RANTES）中高度富集。值得注意的是，与AML外泌体共同孵育降低了NK-92细胞表面CXCR3的表达，这表明AML外泌体下调CXCR3水平可能是配体介导的，并导致NK-92细胞迁移到肿瘤部位的减少（图1）。这些发现表明TDEs可以影响几个重要的生物学过程，包括趋化性和免疫细胞（如NK细胞）在肿瘤部位的募集。为了进一步阐明这一观察结果，研究人员检测了肿瘤外泌体对IL-2依赖性NK细胞增殖途径的影响。随后的结果表明，不仅TS/A外泌体，而且来自MDA231（人类乳腺癌）、A2058（人类黑色素瘤）和4 T.1（小鼠乳腺癌）细胞系的外泌体都能显著阻断IL-2诱导的NK细胞增殖。对IL-2R下游信号通路的更详细研究表明，经TDEs处理后，NK细胞中p42/p44和Akt（PI3K的底物）的活性没有改变。然而，由于观察到磷酸化Stat5水平降低，外泌体能够抑制Jak3的表达。特别值得注意的是，Stat5磷酸化的结果降低取决于TDEs的浓度（图1）。同样，在用肿瘤外泌体处理的NK细胞中，也观察到细胞周期蛋白D3及其底物Rb磷酸化水平的剂量依赖性降低。然而，研究发现，经TS/A外泌体处理的NK细胞的细胞毒性活性降低并非由于细胞凋亡，并且与TS/A外泌体共同孵育不会改变NK细胞的活性。来自人类肿瘤细胞的外泌体也被发现选择性地损害外周血淋巴细胞对IL-2的反应。其他研究也显示，与AML外泌体孵育的NK-92增殖减少，并且在注射胃癌衍生外泌体后，CD8+T和NK细胞的频率降低；然而，这些抗增殖效应还没有被归因于诱导细胞凋亡。用多发性骨髓瘤来源的外泌体（MM-EXs）治疗也不影响NK细胞的凋亡和增殖（图1）。尽管NK细胞能抑制肿瘤形成的早期阶段，但它也能通过细胞毒性功能根除实体瘤。然而，研究证实肿瘤细胞强烈抑制NK细胞的杀瘤活性。最近的数据表明，除了减少NK细胞的数量外，肿瘤外泌体也是在肿瘤环境中降低NK细胞的细胞溶解活性的候选物。已经证明，用AML外泌体处理NK-92细胞可显著抑制其对K562细胞的细胞毒性。同样，经胰腺癌衍生EVs预处理的NK细胞对胰腺癌干细胞的细胞毒性降低。这种机制可能有助于CSCs避免NK细胞的清除，从而可能导致肿瘤复发。有趣的是，从胰腺癌细胞中提取的唾液外泌体在体外和体内也显示出降低NK细胞的细胞溶解潜能。同样，研究还表明，腹腔注射小鼠乳腺TS/A或4 T.1肿瘤细胞系产生的外泌体后，NK细胞的细胞毒性受损。此外，虽然在常氧和低氧肿瘤来源的MVs中观察到相似的摄取模式，但与常氧或低氧MVs共同培养的NK细胞显示出不同水平的细胞毒性。引人注目的是，与常氧MVs处理的NK细胞相比，缺氧肿瘤源性MVs处理的NK细胞对IGR Heu或K562肿瘤细胞的细胞毒性显著降低（图1）。其他研究表明，AML和头颈癌（HNC）患者的外泌体以及胶质母细胞瘤衍生的外泌体（GBex）显著抑制人类NK细胞功能。研究发现，只有来自原代ccRCC细胞（T）的外泌体可诱导NK细胞功能障碍。更重要的是，研究结果显示，从晚期（III/IV）ccRCC细胞分离的外泌体对NK细胞的抑制作用比早期（I/II）的抑制作用更强（图1d）。由于TDE对免疫细胞有很大的影响，因此预计暴露于肿瘤外泌体也会改变NK细胞产生的细胞因子。肿瘤坏死因子-α（TNF-α）和干扰素-γ（IFN-γ）是活化NK细胞产生的两种主要细胞因子，协调抗肿瘤免疫反应。胆管癌的外泌体可显著抑制NK细胞分泌TNF-α，降低其抗肿瘤功能。同样，与胰腺癌（L3.6pl）衍生EV共同培养的NK细胞在TNF-1和IFN-γ产生方面也有显著降低。用TS/A（小鼠乳腺癌细胞）外泌体治疗也显示出显著抑制IL-2刺激的NK细胞中IFN-γ的释放，这表明肿瘤外泌体可通过激活的NK细胞损害细胞因子的产生。在经常氧或低氧肿瘤源性MVs预处理的NK细胞中也观察到IFNγ表达降低。值得注意的是，与常氧MVs相比，低氧肿瘤MVs对NK细胞产生IFNγ的减少表现出更显著的影响，并且发现外泌体处理的NK-92/NKD细胞的细胞毒性降低与这些细胞表达IFNγ的减少直接相关（图1）。

NK细胞持续暴露于肿瘤细胞表面表达的配体已被证明会导致NK细胞异常。如前所述，NKG2D的缺失或下调水平是功能性抑制的NK细胞的一个共同特征，其可能由肿瘤或来源于肿瘤/周围细胞的可溶性因子诱导。研究表明，激活受体NKG2D的MHC I类相关链（MIC）A和MICB配体可以从肿瘤细胞中脱落，它们在患者血浆中的存在与受损的NK细胞反应和疾病进展密切相关。由于MICA和MICB在肿瘤外泌体上的存在已被证实，因此，外泌体MICA/B可能能够改变NKG2D的表达，类似于其可溶性对应物。关于这一点，AML外泌体富含膜相关的MICA/MICB，被认为是NKG2D下调和伴随NK细胞毒性降低的原因。通过检测NKG2D的下调是否依赖于外泌体表型，先前的一项研究发现，从NKG2D配体阳性肿瘤细胞分离的外泌体，包括间皮瘤细胞系、前列腺细胞系（PC3或DU145）、EBV-B淋巴母细胞（IB4），或从间皮瘤患者胸膜液（PF）中纯化的外泌体能够降低NK细胞中NKG2D的表达。相反，来自PBMC或成纤维细胞的外泌体对NKG2D表达没有影响。结果表明NK细胞NKG2D的减少是外泌体表型依赖性的，并且发生在肿瘤中，而非肿瘤外泌体中。然而，另一方面，用抗CD63单克隆抗体预处理22Rv1外显体，并不显著影响NKG2D的表达。上皮性卵巢癌（EOC）外泌体对两种抗癌免疫重要细胞毒性途径的免疫抑制能力，即NKG2D受体-配体途径和DNAM-1-PVR/nectin-2途径，也进行了研究。结果表明，从EOC肿瘤外植体和EOC细胞系培养上清液中分离的外泌体，以及从EOC患者中分离的腹水液，在其表面不同且组成性地表达来自MICA/B和ULBP家族的NKG2D配体，而DNAM-1配体很少表达，且与外泌体膜表面无关。发现含有EOC外泌体的Te NKG2D配体显著下调外周血单个核细胞（PBMC）上NKG2D受体的表达，而DNAM-1受体则不受影响。值得注意的是，观察到NKG2D表达下调与NKG2D受体配体介导的NK细胞在体外对OVCAR-3和K562细胞的脱颗粒和细胞毒性较小有关。推测EOC外泌体作为诱饵，从而损害NKG2D介导的NK细胞活性（图2）。

转化生长因子β（TGF-β）是骨形态发生蛋白（BMP）-激活素家族的一种细胞因子，众所周知，它参与了一系列涉及免疫反应调节的过程。它对包括NK细胞在内的免疫细胞有抑制作用，这一点尤其为人所知。证据表明，TGF-β降低了NK细胞上关键激活受体（NKp30和NKG2D）的表面表达，并且这种细胞因子的水平升高与癌症患者NK细胞的活性受损有关。最近的研究表明，肿瘤外泌体也携带高水平的膜相关TGF-β，其可诱导与其可溶性对应物类似的免疫抑制效应。目前已有多份报告显示，从AML和肾细胞癌（ccRCC）患者或间皮瘤细胞分离的外泌体/MVs含有TGF-β。然而，在AML外泌体上也有报道称，TGF-β的前肽亚型由与成熟TGF-β（~50 kDa）共价结合的LAP组成，这种潜在形式的TGF-β在尿素处理后被解离，进一步增加可溶性TGF-β水平。此外，当重组TGF-β添加到肿瘤外泌体中时，NKG2D表达轻微或无进一步变化，表明肿瘤外泌体单独可最大程度地激活TGF1依赖的NKG2D下调途径。基于这些观察结果，研究人员假设外源性TGFβ可能与细胞表面的TGFβRI/II受体相互作用，在NK细胞中诱导抑制性下游信号，从而导致NKG2D表达降低。当与TGFβ+外泌体共同孵育的NK细胞中观察到SMAD2/3磷酸化增加时，这种情况变得明显。含有TGF-β的外泌体也显示下调NK细胞中Tbet转录因子的表达。然而，TGFβRI/II抑制剂（LY2109761）或TGF-β敲除可将SMAD 2/3磷酸化降低至基线水平。这些发现支持肿瘤外泌体可将TGFβ输送至与TGFβRI/II结合的NK细胞表面，随后上调SMAD 2/3磷酸化并降低Tbet表达水平，导致NK细胞中NKG2D表达降低和细胞溶解活性消失（图3）。

NK细胞越来越被证明是治疗癌症，特别是血液恶性肿瘤的一种有前途的工具。此外，还有大量正在进行的临床试验，研究NK细胞免疫疗法治疗实体瘤的有效性。然而，最近在一项针对AML患者的研究中发现，来源于肿瘤细胞的外泌体抵消了NK-92细胞治疗的作用（图4a）。事实上，NK细胞也通过众所周知的抗体依赖性细胞毒性（ADCC）过程参与抗肿瘤免疫。然而，令人惊讶的是，先前的研究表明肿瘤外泌体可消除NK细胞的ADCC活性。例如，已经证明表达HER2的外泌体作为诱饵保护癌细胞免受NK细胞介导的ADCC。这些发现支持了肿瘤外泌体对NK细胞治疗和单克隆抗体（mAb）的治疗效果具有决定性破坏作用的观点（图4b）。

迄今为止，通过研究TDEs对NK细胞的影响可以清楚地看出，正如其他抗肿瘤免疫细胞所描述的那样，肿瘤外泌体是荷瘤宿主免疫抑制的重要参与者。此外，人们强烈认为这些病毒大小的颗粒会干扰免疫治疗并诱导对化疗的耐药性。外泌体抑制/去除的概念已经得到重视，然而，尽管如此，似乎将IL-15添加到免疫疗法中，包括NK细胞为基础的疗法，可以部分通过干扰TDEs的抑制作用增加其益处。这一概念得到了几项临床试验的支持，这些试验表明，IL-15与NK细胞或其他免疫疗法的联合使用可增强治疗效果，并可显著增加缓解作用。一些报道还表明，肿瘤细胞在基因毒性应激和表观遗传药物治疗或放疗后的外泌体可增强NK细胞的抗肿瘤反应。另一方面，尽管本综述讨论了几种生物分子，但也可能有一些未知/研究较少的分子参与肿瘤NK细胞功能障碍。因此，需要进一步研究TDEs介导的NK细胞损伤的分子基础。总之，深入了解TDE介导的NK细胞功能障碍的病理作用和机制将能够进一步提高NK细胞以及其他免疫疗法在治疗癌症方面的潜力。

教授介绍

Reza Hosseini博士就职于伊斯法罕医科大学医学院免疫学教研室。他的主要研究方向是肿瘤外泌体在NK细胞功能障碍中的关键作用。肿瘤来源的外泌体（TDEs）可被NK细胞吸收或通过受体-配体相互作用诱导下游信号，从而下调其抗肿瘤活性。也有大量证据表明肿瘤外泌体含有过多的表面配体和生物分子，可干扰NK细胞的募集、细胞因子的产生、分子表达和细胞溶解活性。因此，TDE也被认为可以抵消NK免疫疗法的作用。Reza Hosseini博士期望从机制角度研究TDEs在NK细胞功能障碍中的作用，并探讨在治疗癌症时对抗外泌体依赖性肿瘤诱导的NK细胞损伤的临床意义和治疗方法。

参考文献

Hosseini R, Sarvnaz H, Arabpour M, et al. Cancer exosomes and naturalkiller cells dysfunction: biological roles, clinical significance andimplications for immunotherapy. Mol Cancer. 2022;21(1):15.doi:10.1186/s12943-021-01492-7