一、为什么要做RNA-seq
先说下生物体内RNA的大致组成：
编码RNA:根据中心法则我们知道，DNA转录为mRNA，mRNA通过tRNA翻译为蛋白质，蛋白质行使生命功能,例如呼吸，运动，消化等等。人类只有2万左右个蛋白质编码基因，这些编码基因只占人类全基因组的2%左右。mRNA占细胞RNA总量的2%～5%， tRNA占细胞RNA总量的15%左右。
非编码RNA:有些DNA转录为RNA后，不继续编码蛋白质，这种RNA叫非编码RNA（ncRNA），包括microRNA,lncRNA,cirRNA，之前人们认为这些RNA是“垃圾”，但是近年来的研究证明，这些RNA对编码基因发挥着重要的调控作用，是当下研究的热点。
rRNA：核糖体RNA,占RNA总量的80%左右。
广义上说占总RNA95%左右的rRNA和tRNA也属于非编码RNA，但是一般研究中，使用的是它的狭义概念，即除去rRNA和tRNA之外的非编码RNA。
正常情况下，非编码RNA调控基因的转录翻译，这些都是有序进行的。
但是当处于异常条件下，或者由于自身衰老变异或者受到外部的刺激，比如细菌病毒的感染，射线照射等，这之后往往导致非编码RNA表达的变化，进而影响蛋白表达的变化，从而引起一系列的病理反应，最终导致疾病。
那么反过来，如果我们想了解某一疾病具体的发病机理，我们是不是可以提取某一疾病状态下组织或者细胞的总RNA，去分析它们和正常组表达的异同，我们有理由相信，这些差异表达的RNA分子，很可能与发病机制有关，研究这些差异分子，可以给我们对这一疾病的发病机制的研究提供重要线索，从而研发出更有效的诊断和治疗方法。
二、RNA-seq的大致流程
通过上面的分析，接下来面临的问题就是，我怎么分析某一疾病状态下组织或者细胞所有RNA的表达情况，一个一个分析，肯定不现实，而且可能还有很多未被发现但是很重要的分子。怎么办？只有一个办法，转录组测序，即RNA-Seq, 某一条件下所有转录出来的RNA碱基序列，我都给你测出来是什么。
那么这涉及6个步骤
1、提取组织或细胞总RNA后，除去占大部分的rRNA和tRNA，剩下编码RNA 和非编码RNA
2、对这些RNA进行测序，理想情况下，是直接检测，但是不现实，只有通过碱基互补配对的合成过程，才能知道原来样品中模板的序列，但是这个合成的长度是有限制的，所以只能先把这些RNA切割成小片段，再检测这些小片段的序列。具体原理见陈巍学基因视频。这个过程得到两种数据，一种是许许多多的碱基序列，一个是这些序列的表达频率。也就是一个是RNA是什么碱基序列，一个是RNA表达了多少量
3、由于上一步把RNA切割了，好像是一块拼图打散了，所以，这一步需要将这一个个的小块再重新拼成一个完整的图片。也就是比对，将检测到的RNA碱基序列，比对到参考基因组上，看某段RNA位于参考基因组的哪段序列上。这一步就好像一个拼好的拼图，上面有高高低低的小块，有些分子表达量高，它对应那个小块就高，反之就低。通过这一步，实验组和对照组都得到一个高高低低的拼图。
4、把实验组和对照组的拼图比较一下，看哪些RNA小块表达量是不一样的。或者你高我低，或者我高你低，从而得到这些差异表达基因名字的列表。因此这一步的结果都是一些基因名字或者转录本编号了。
5、将这些差异表达的分子，进行下游功能分析，比方看看它们都跟什么信号通路相关啊，可能跟什么功能有联系啊等等。这一步得到的就是很多结果图了。
6、下一步就是将筛选到的差异基因，结合你感兴趣的生物学功能或者过程，挑选出几个，进行再进一步的机制研究。这步就是湿实验了，也是决定文章层次的核心，这是需要人力和财力，再加上运气的事情，不过就算不做这一步，前5步也能发篇小文章灌灌水了。由于这一步涉及基础医学的机制研究方法，不在这篇文章的讨论范围内。
三、为什么需要学习生信知识
样品送测序仪器后，也就是上述第2步后得到会产生大量的数据，可能是多少个G的级别，有几万，甚至几十万的碱基序列，首先你要比对到参考基因组吧，然后你要看看实验组和对照组哪些基因表达有差异吧，其实这不是很复杂的事情，就是数据量太大了，如果就几十个，你完全可以用EXCEL查找，再标记，但是几十万个基因，谁能做到啊。所以现在需要一种工具，可以对数据进行批量编辑和操作。
感谢计算机发达的技术，前人早就帮我们想出来。Linux操作系统就可以实现对大量数据的批量编辑
，R语言可以实现大量数据的统计和做图。
好了，我们的下一步就是学习Linux操作系统和R语言了。
但是这两个部分包含了很多很多的知识，我们完全零基础，要是从头开始学，效率有点低，毕竟不是专业计算机出身，不需要一下子把所有东西都学会，先把目前需要掌握的学到，将来再举一反三，慢慢学其它的。
所以现在就开始模拟实战，从一个测序数据的样本开始，看看是怎么一步步得到文章中的结果的。
未完待续...
这两天宝宝得了幼儿急疹，耽误了几天，现在真的是上有老，下有小了，生活的压力会逼得你迅速成长起来。到这个时候才能深刻体会到时间是非常宝贵的，尽量少干不必要的事情，抓紧提升吧~
