Nat Biotech | MRI转基因高通量无创成像
原创 骄阳似我 图灵基因
收录于话题#前沿分子生物学技术
撰文：骄阳似我
IF：54.908
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亮点：
1. 本文作者及其团队利用核磁共振(MRI)技术开发了一种来实现深层组织无创双色成像的新方法，其称为gene REFORM。与单一低通量的MRI相比，此方法可以实现高通量的MRI成像，并精确定位深层组织中的基因表达，实现深层组织基因表达的可视化追踪及定位。
2. 本文作者及其团队通过计算生物学的方法，计算并设计了在深层组织中能够实现双色MRI可视化的报告基因及探针，建立了多色的图像报告系统。
3. geneREFORM系统不仅在肿瘤模型中能够定位准确并可视化追踪深层组织的无创双色成像，并且在非肿瘤模型中也具有适用性。
由于组织对可见光不透明的特性，因此对于活体动物基因表达的成像，很难用重组荧光蛋白的方案来解决。对于活体动物深层组织的转基因成像，目前核磁共振(MRI）技术应用得较为广泛，但是核磁共振只能报告单一的基因，效率较低。活体动物深层组织的多基因表达成像仍然是一个待需解决的问题。
近期，在Nature biotechnology杂志上发表了一篇名为“Computationally designed dual-color MRI reporters for noninvasive imaging of transgene expression ”的研究文章。在这篇研究中，科学家们开发了一种称为geneREFORM的系统，计算并设计了一组双色报告基因及探针，建立了双色的基因成像系统，借助于现有的MRI技术，可以实现活体动物深层组织多基因的无创双色成像，对于基因表达过程中的精确定位以及持续追踪提供了一个有效的高通量平台，这项开创性的研究为活体动物基因表达的多路深层组织定位铺平了道路。
在深层组织荧光成像中，大规模高通量的诱变策略能够筛选出一对可用的报告基因，但由于MRI技术低通量的特性，这种传统的通过诱变筛选报告基因的方法无法适用于MRI。为了克服这一障碍，研究团队在这里使用了一种计算蛋白并设计方法来生成多色MRI的报告基因，同时用于正交基因的定位。GeneREFORM由一对MRI可检测的报告探针组成(图1a)，它能与设计的报告基因耦合(dNKs，图1b)，研究团队为了呈现报告探针的多色MRI可视化，他们还引入了化学交换饱和转移(CEST)的对比机制(图1c)。具体来说，他们评估了5-MDHT和pdC的伪颜色编码(图1d)，将其分别与多底物dNK酶、单纯疱疹病毒1-胸苷激酶(HSV1-TK)和果蝇dNK(Dm-dNK)配对。并用各自的MTRasym图(图1f)分辨质谱(图1e)显示，在5ppm(5-MDHT)和6ppm(pdC)时，可以使用品红色(绿色(Δω=5ppm)和Δω=6ppm)的MRI伪色(图1g)进行映射，与基于多肽的CEST颜色相比，光谱的分辨率得到提高。研究人员同时绘制了两种探针的CEST效应作为应用饱和脉冲的函数(图1h)和其浓度的函数(图1i)，显示了在较低磁场下工作的MRI扫描仪上，这些探针也发现了类似的趋势。这些结果进一步表明，5-MDHT和pdC可以作为脱氧核糖核苷基报告探针，具有光谱分辨的伪色MRI特征。
图1.MRI伪彩色系统的建立
在成功实现了对pdC和5-MDHT的CEST信号进行MRI伪色分配后，科学家们为了提高由积累的脱氧核糖核苷产生的MRI对比度，即使图像成像的对比度质量更好，他们使用pross蛋白稳定性设计算法来提高dNKs的细胞表达水平（图2）。利用pdC的荧光，可以评估其被dNK磷酸化时的细胞捕获状态。与各自的野生型变异相比，Dm-dNK_7的表达水平显著(P=0.001)和0.001以上(图2a，b)。然后科学家们为了评估评估野生型和设计的dm-dNK表达细胞中的细胞积累，利用应用荧光激活细胞分选(FACS)技术进行分析，结果显示，与野生型Dm-dNK相比，三种Dm-dNK突变体的pdC积累都更高(图2c)，在表达dm-dNK_7的活细胞中，pdC的积累增加了10倍以上(图2d，P=0.003)。这些数据表明，pross提高了Dm-dNK_7的细胞耐受性，表现为其细胞表达水平的增加，在其成功转化后，更多的细胞积累了pdC底物。为了使GeneREFORM能够适用于复杂的生物环境，研究人员对Dm-dNK_7活性位点进行了一轮合理的单位点诱变(图2e)。为了评估结构设计的准确性，研究人员确定了Dm-dNK_7C的晶体结构(图2h)。总的来说，实验结构与亲本酶非常匹配，尽管有15个表面突变，但该突变还可能提高了pdC的结合，从而提高了催化效率(图2i)。因此，Dm-dNK_7C被发现是pdC转换的最佳设计，显示出增加的活性(比野生型Dm-dNK高15倍，图2f)。研究人员继续在HEK-293细胞中表达了3种设计的hsv1-tk(图2j)。HSV1-TK_7有20个突变，比野生型HSV1-TK的表达水平增加了6倍以上(图2k，P=0.046)。最后，对表达5-MDHT孵育的HSV1-TK突变体的细胞的细胞内含量进行了核磁共振研究，以评估其细胞积累，发现与未转染的细胞相比，表达HSV1-TK_7B(Tyr87Phe)的细胞的活性增强了10倍以上(图2l，P=0.03)。在这里，5-MDHT-MP的净积累，可以达到更高水平的HSV1-TK_7B表达(图2m)，而pdC-MP水平无法检测，反映了设计的正交性。总得来说，研究人员通过计算生物学的方法提高并验证了dKNs的细胞表达水平，为高对比度的成像及图像质量提供了较高的下限。图2.高活性和正交的Dm-dNK和HSV1-TK报告基因的设计
最后，激动人心的时候到了，在双色成像平台以及高质量的探针工作完成之后，研究团队开始利用geneREFORM进行多基因的MRI体内体外成像！他们评估了使用GeneREFORM用MRI绘制基因同时表达的能力（图3）。首先将报告基因与荧光报告基因融合，在CHO癌细胞中稳定表达，检查获得的生物耐受性稳定CHOHSV1-TK_7B-mCherry和CHODm-dNK_7C-GFP细胞系（图3a），正交积累pdC和5-MDHT(图3b)。然后将每种细胞类型与pdC和5-MDHT的混合物一起孵育，检查细胞内内容物的CEST-MRI特征。结果显示，CHOHSV1-TK_7B-m和CHODm-dNK_7C-GFP裂解物(图3cd)产生了在预期的化学偏移，并且被分配给品红色(Δω=5ppm，P=0.049)和绿色(Δω=6ppm，P=0.03)。接下来，研究人员把geneREFORM在两种动物模型中进行体内性能评估(图3e)。首先，在颅内注射CHODm-dNK_7C-GFP和CHOHSV1-TK_7B-mCherry细胞后7天，在静脉注射含有5-MDHT和pdC混合物的溶液前后，分别获得了两个CEST-MRI数据集。从注射前获得的探针混合物中减去注射后1小时获得的MTRasym图(∆ω=为5，∆ω=为6ppm)，得到伪彩色CEST图(1mm厚度)，然后将其叠加在解剖MRI上(图3f)。同一扫描小鼠大脑40μm低温切片的荧光图像(图3g)显示，表达的报告基因的荧光信号与GeneREFORM的MRI伪色具有良好的相关性。与其他基于MRI的方法相比，即使在合成核苷的预期频率(∆ω=6ppm和∆ω=5ppm)的最小重叠信号中(图3i，P=0)，这两种人工颜色的光谱分辨也显示出了典型的cest谱分离(图3h)。所有的这些数据证实了GeneREFORM可以应用于体内区分两种细胞表达不同dNKs的肿瘤模型。最后科学家们将geneREFORM在非肿瘤模型中进行了尝试，他们利用AVV载体将工程dNKs传递到小鼠大脑，结果显示脑切片的荧光图像反映了GeneREFORM在非肿瘤模型中的适用性(图3j)。图3.geneREFORM的体内外MRI。
总之，研究人员展示了一种不基于发光的基因编码报告系统genereform的开发和实现，该系统能够以多色、无创的方式定位基因表达，可以在MRI的平台基础上实现多基因高通量的图像成像。在基因表达，神经递质信号和代谢途径等领域都会有巨大的应用潜力。同时，计算生物学设计双色系统的这一策略，也可以启发后续的科学家们进一步用额外的“颜色”进一步丰富GeneREFORM调色板，从而将深层组织活体成像的“多色”成像工具箱扩展到更广阔的空间。
教授介绍：
Amnon Bar-Shir
Amnon Bar-Shir是以色列魏茨曼科学研究所的科学家，以色列科学研究生物技术公司首席科学家。Amnon Bar Shir博士的现任职务是Helen和Milton A.Kimmelman磁共振研究所职业发展主席。Bar Shir博士的研究得到了Clore高场磁共振成像和光谱学研究所的支持。
参考文献：
Amnon Bar-Shir et al. Mechanisms of immune activation and regulation:lessons from melanoma
[J]. Nature biotechnology. 2022 Jan31:10.1038/s41587-021-01162-5
