Single-cell transcriptomics reveals the alteration of peripheral blood mononuclear cells driven by sepsis.
南方医科大学第二临床医学院和广东省人民医院急诊与重症医学科
影响因子： 3.297，2020年1月13日提交，于2020年1月23日接受发布，10天就接收了，呜呜！
doi：10.21037 / atm.2020.02.35
背景：败血症是由感染引起的一种严重的全身性炎症反应综合征，死亡率极高。外周血单个核细胞（PBMC）在针对感染的免疫反应中起关键作用，其组成和功能在败血症中发生了根本性的改变。在这里，作者想在单细胞转录水平上表征败血症中PBMC的变化。
方法：作者从7名败血症患者和4名捐献者中分离了PBMC。基于BD Rhapsody，通过单细胞RNA测序生成PBMC，并通过无监督聚类和注释分析对细胞类型进行聚类和命名。
结果：对PBMCs进行了6种细胞类型的分析，详细显示了T细胞和单核细胞的生物学特性。作者注意到，单核细胞可以聚集为6个子集，在败血症驱动的组成，基因谱和信号传导途径的改变中具有很大的异质性。此外，代表性基因的表达与败血症临床指标在单核细胞簇（如NEAT1）中的表达高度相关。
结论：尽管该研究是初步的，但作者揭示了败血症特异性的PBMC改变和相关途径。这些结果提供了败血症驱动的PBMC组成，基因谱和途径特征的全景图，这为了解临床实践中的疾病进展或治疗提供了独特的视角。
在本研究中，作者基于BD Rhapsody技术，采用了混样的方法做的单细胞测序，通过单细胞转录组学对败血症中PBMC的生物学特性进行了全面的创新分析，着重观察了单核细胞的变化，在单核细胞的不同亚群中功能和生物学特性差异很大，某些代表性基因的表达很高。与败血症驱动的单核细胞簇中的败血症指标有关。文章样本疾病组7例，分析内容较少，数据没有做很深的挖掘，估计这也是没有发更高分的原因吧。
方法
分离-PBMC-制备混悬液-上机测序（BD Rhapsody单细胞分析系统）-tSNE降维-标记基因的鉴定和细胞类型注释-信号通路分析（GSVA）-细胞类型比例分析
结果
1. PBMC的单细胞转录组分析，比较对照和败血症差异
从7名败血症患者（SP1-SP7）和4名对照（2名供体合并为1个样品，总共2个用于测序的样品，CT1-CT2）和4个对照中分离了PBMC。
然后通过单细胞RNA测序技术（BD Rhapsody）分析这些样品（图1A）。回收的细胞总数为26,674，其中对照组为3,183，败血症患者为23,491，中位基因范围正常（图1B）。根据表达谱，PBMC聚类为9种细胞组成，这些组成由t分布随机邻居嵌入（tSNE）表示；每个细胞部分都用条形图表示（图1C）。所有细胞还通过疾病状态（对照和败血症）进行区分，以显示由败血症驱动的细胞簇的变化（图1D）。
作者确定了6种主要细胞类型，包括：
B细胞（MS4A1 +），
DC细胞（CD11b +），
单核细胞（CD68 +），
自然杀伤细胞（CD3D-和NKG7 +），
自然杀伤性T细胞（CD56 +），
图1来自单细胞水平的对照组和败血症患者的PBMC的转录组图谱
（A）显示PBMC转录组实验的示意图；
（B）通过质量过滤的细胞数量和基因的中位数（2个对照样品CT1-CT2； 7个败血症患者SP1-SP7）；
（C）PBMC的tSNE图可视化显示了6种细胞类型（左），条形图显示了正常对照和败血症患者的细胞比例（右）；
（D）正常起源对照的受试者和败血症患者以明显的颜色显示；
（E）二维tSNE可视化显示的已建立细胞标志物的表达水平。
2. 败血症相关转录组特征中T细胞亚群的改变
T细胞是巨大的细胞类型，似乎能够聚集成更多子集（图1C）。为了进一步了解T细胞的特定种群迁移，作者使用Seurat R包从对照和败血症中提取了所有T细胞。T细胞被分为2个子集（细胞毒性T和辅助T）（图2A）。正常对照和败血症之间在代表性选定基因的表达分布上没有显著差异（图2B）。比较对照组和患者之间的显著差异基因，作者发现RPS26，HLA-C，RBM38等被下调，而TXNIP，PPPDF，PINM2等上调。败血症相对于对照在败血症中高表达，表明败血症诱导的基因表达发生更广泛的变化（[图2C] (http://atm.amegroups.com/article/view/37087/html#figure2)）。
为了评估正常和败血性T细胞之间的独特生物学特性，作者进行了GSVA分析标志信号通路。败血症驱动的T细胞在代表性途径中不同于正常途径，例如，败血症与对照的T细胞形成对比，雌激素反应，p53途径和细胞凋亡均被富集，但IL-6途径被显著抑制（图2D）。一起，T细胞可以进一步聚类为正常情况下几乎相同种群的细胞毒性T和辅助T，败血症患者T细胞的基因表达和信号通路与正常人不同。
图2T细胞的单细胞分析
(A) 2个T细胞簇的二维tSNE可视化，不同的颜色代表不同的簇（细胞毒性T和辅助细胞），（顶部和底部）分别显示对照和败血症；
（B）通过小提琴图显示与对照和败血症中的T细胞相关的代表性选择基因的表达分布；
（C）热图代表来自对照和败血症的T细胞中表达最高的差异基因，正常组中高表达20个基因，败血症中高表达20个基因；
（D）正常和败血症诱导的T细胞之间信号途径差异的条形图。
3.败血症促使单细胞转录组学水平改变单核细胞亚群
作者进一步将单核细胞聚集成6个子集，然后评估败血症对单核细胞的影响。与对照相比，败血症中5个单核细胞亚群的扩增显著，包括
CD14 + NEAT1 + SELL +单核细胞，
CD14 + NEAT1 + CCR1单核细胞，
NEAT1 + CD163 +单核细胞，
CCL3L1 +单核细胞，
CD16 +单核细胞，
而巨噬细胞簇分布的改变为在对照和败血症中没有明显的数量差异（图3A）。CD14，S100A8和S100A9在正常和败血症驱动的单核细胞中均大量表达****，在转录水平上显示出经典的单核细胞谱（图3B）。此外，败血症驱动的单核细胞中的HLA-DRB1和HLA-DRA与正常相比显著下调，这提示单核细胞的免疫衰竭（图3B，C）。炎症相关蛋白在化脓性单核细胞（如CCL3，IL1B，CCL4，NLRP3）中被急性激活并增加（图3D）。同样，败血症的单核细胞中炎症相关的途径（IL-6信号途径和补体反应等）也得到增强。同时，单核细胞的凋亡被激活，氧化磷酸化被明显抑制（图3D）。有趣的是，雄激素反应也明显降低（图3D）。
图3单核细胞细胞簇的单细胞分析
（A）6个单核细胞簇的二维tSNE可视化，不同的颜色代表不同的簇（CCL3L1 +单核细胞，CD14 + NEAT1 + CCR1 +单核细胞，CD14 + NEAT1 + SELL +单核细胞，CD16 +单核细胞，单核细胞/巨噬细胞，NEAT1 + CD163 +单核细胞/ DC ）（顶部和底部）分别显示对照和败血症；
（B）对照和败血症中与单核细胞相关的代表性选择基因的表达，用小提琴图表示；
（C）热图代表来自对照和败血症的单核细胞中表达最高的差异基因，正常组中高表达20个基因，败血症中高表达20个基因；
（D）正常和败血症诱导的单核细胞之间信号途径差异的条形图。
来自败血症的单核细胞聚集成6个子集，其中大多数细胞增殖很明显（图3A，4A）。值得详细研究每个样本中每个子集的变化。6个簇中的细胞比例在败血症中剧烈波动（图4B）。与其他子集相反，聚类8（单核细胞/巨噬细胞）和聚类11（CD16 +单核细胞）都引人注目。作者分别比较了正常和败血症中簇8和簇11的重要基因特征，以评估其由败血症驱动的独特生物学特性（图4C，D）。值得注意的是，与对照相比，总共7个败血症中HLA-DQB1和HLA-DRA均被下调（图4C）。在这里，败血症的CCL家族（CCL4L，CCL3，CCL4，CCL3L）与正常人相比有所增加，但是在7名败血症患者中其表达水平的差异是显著的（图4D）。此外，与对照有关的患者中TNF的表达显著上调，在所有败血症样品中高度一致（图4D）。分层聚类分析显示，在败血症驱动的单核细胞的6个子集之间，代表性信号传导途径之间存在显著差异，例如，在大多数典型途径中，簇5被激活，而簇3和簇7均被强烈抑制（图4E）。
图4单核细胞簇在基因表达和信号通路中的变化
（A）单核细胞的tSNE可视化，不同颜色代表6个簇（簇3CD14 + NEAT1 + SELL +）；群集5（CD14 + NEAT1 + CCR1 +）; 集群6（CCL3L1 +）; 群集7（NEAT1 + CD163 +）; 第8类（巨噬细胞）; 群集11（CD16 +），针对于于原始群集。右（上和下）分别显示正常对照和败血症患者。
（B）PBMC中群集百分比的条形图；
（C，D）热图代表每个样品（2个对照组和7个败血症患者）单核细胞簇8和簇11中表达的最高差异基因，正常组中20个基因高表达，而20个基因高表达败血症
（E）6个单核细胞簇中差异信号途径的分层聚类分析，红色和蓝色分别表示增强和抑制途径活性。
综上所述，单核细胞进一步聚集为6个亚群，它们大量增殖并在败血症的驱动下改变了生物学特性。
4. 败血症指标与单核细胞簇的相关性
为了研究败血症指标与单核细胞之间的关联，作者进行了Spearman秩相关分析。PBMC中第7类和第11类的比例分别与ICU中的NEWS得分第一天和ICU中的PaO 2 / FiO 2第一天显著正相关（图5A）。此外，详细证明了临床指标与化脓性单核细胞簇中代表性基因表达之间的相关性（图5B）。
图5 败血症中败血症临床指标与单核细胞簇之间的关联
（A）PBMC中临床指标与簇的百分比之间的相关性；
（B）在簇6、7、8、11中临床指标与代表性基因表达之间的相关性。Spearman等级进行相关性分析（校正后的P <0.05）；红色和蓝色分别表示正相关和负相关。
总结
在本文中，作者收集了来自供体和败血症患者的PBMC，然后通过基于BD Rhapsody的单细胞转录组测序分析了败血症驱动的PBMC的功能和组成的变化。PBMC分为6种细胞类型，包括B细胞，DC，单核细胞，NK细胞，NKT细胞和T细胞。作者进一步分析了败血症驱动的T细胞和单核细胞的变化。值得注意的是，单核细胞可以详细分为6个子集（CD14 + NEAT1 + SELL +单核细胞，CD14 + NEAT1 + CCR1 +单核细胞，NEAT1 + CD163 +单核细胞，CCL3L1 +单核细胞，巨噬细胞，CD16 +单核细胞），其中大多数在败血症中增殖。显示了T细胞和单核细胞的生物学特性（种群迁移，基因表达，信号通路），其中大多数与免疫力和炎症有关。最后，作者进一步分析了单核细胞簇中代表性基因谱与患者临床指标之间的相关性。一些基因的表达与败血症临床指标高度相关，这提示可能通过单细胞测序找到新的诊断或治疗败血症的靶标。这个想法是新颖的，需要进一步研究。
出乎意料的是，诸如NEAT1（图3B），MALAT1和LINC01871之类的LncRNA被单核细胞，DC和其他细胞（簇7定义为NEAT1 + CD163 +单核细胞/ DC；簇17，NEAT1 + CD1c + DC）覆盖。高表达LncRNA败血症是零星报道（24，25）提出了败血症的诊断生物标志物，并涉及NF-κB炎症信号通路。在这项研究中，作者显示至少在四个单核细胞簇中，尤其是单核细胞和DC中，NEAT1升高，暗示在不同的单核细胞中具有正功能。
参考：
1.单细胞（BD Rhapsody）分选系统操作质控流程
http://www.novelbio.com/blog/c2/8.html
2.揭秘单细胞测序黑马BD的5大隐藏技能 - 新闻 - 仪器谱
