1. Author
Michael C. Lawrence团队研究胰岛素和胰岛素样生长因子如何向细胞发出信号。胰岛素是控制血液中糖摄取及代谢的主要激素。胰岛素样生长因子参与人体正常生长。胰岛素和胰岛素样生长因子的异常会导致多种疾病，例如1型和2型糖尿病/癌症和阿尔茨海默病。Michael C. Lawrence试图寻找和开发治疗这些疾病的新疗法。
2. Background
副粘病毒科是负链 RNA 病毒家族，包括许多重要的人畜共患病原体。 人类副流感病毒属于副粘病毒亚科，包括 I 型和 III 型（呼吸道病毒属）以及 II 型和 IV 型（风疹病毒属）。 副流感病毒具有两种表面糖蛋白； 即血凝素-神经氨酸酶（HN）和融合蛋白（F）。 HN具有三种功能：(i) 受体结合（血凝素）活性； (ii)受体破坏（神经氨酸酶）活性，从糖缀合物中释放末端唾液酸（N-乙酰神经氨酸，Neu5Ac）残基； (iii)融合激活F蛋白。 相比之下，在流感病毒上，血凝素负责受体结合和膜融合，而神经氨酸酶活性则在单独的蛋白亚基上。
3. Methods
1. PIV3 HN蛋白的纯化表达
2. 神经氨酸酶活性测定
3. PIV3 HN结晶
4. X-射线晶体衍射
神经氨酸酶活性测定
将甲基伞形酮 N-乙酰神经氨酸（MUNANA）以 0.2 mM 的浓度添加到 10 mM CaCl2 中100 mM 乙酸钠 (pH 4.5) 的样品中并在37±8°C 下孵育。 两小时后用 200 mM 碳酸钠 (pH 9.5) 终止反应。 使用荧光计在 365 nm 激发波长和 450 nm 发射波长下对 MUNANA 的水解速率进行定量。
4. Results
实验团队分离纯化得到了HPIV3的HN结构域，通过序列分析发现：相比于NDV的HN结构域，PIV3的β3L23 环要短一些；PIV3 HN 缺乏 NDV HN 中观察到的a 螺旋；PIV3 HN 含有七个二硫键。
在比较两种不同晶型的无配体活性位点的构象时发现：两种晶型之间最显着的差异在于 Y6 的侧链方向，Y6 是一种关键的催化残基，在迄今为止研究的所有神经氨酸酶中都严格保守。E4，在六边形结构和典型流感病毒神经氨酸酶活性位点中与 Y6 形成氢键，在两种结构中具有非常相似的构象。
在研究HN与Neu5Ac时发现：尽管所有三个精氨酰残基都向羧酸根延伸，但只有 R1 和 R5 与其形成氢键 (,3.5 A°)。 在 PIV3 HN 中，b-Neu5Ac 的糖苷羟基氧原子与 Y6 的羟基氧原子 (2.3 A°) 之间观察到非常短的接触。
Zanamivir结合的位置与 Neu5Ac2en 的位置非常接近地重叠。 R1再次发生位移，但方向与 Neu5Ac2en 中看到的方向相反。 Y6与 4-胍基部分形成氢键，并稍微远离引入的配体。 T193还与Zanamivir的 4-胍基取代基形成氢键。 与 Neu5Ac 和 Neu5Ac2en 复合物一样，在结合扎那米韦的活性位点之外没有显着的结构变化。
5. Discussion
作者： Michael C. Lawrence
通讯作者：Michael C. Lawrence
单位：CSIRO Health Sciences and Nutrition，University
of Melbourne
年份：2003.11
期刊：JEM（Journal of Experimental Medicine）
科学问题 ：PIV3的HN结构域是如何与底物结合发挥功能的
结论：这篇文章报道了pH 7.5（高盐，六方晶系）和pH 6.5（低盐，斜方晶系）下的两个非复合结构和pH 7.5下的三个配体结构，具有相似的二聚体缔合。有人提出NDV HN 的“松散”二聚体（pH 4.6）代表蛋白质的受体结合状态，“紧密”二聚体（pH 6.5）代表催化状态。六方晶型和斜方晶型的 PIV3 HN 二聚体结构存在微小差异。结合受体后 HN 结构的变化被作为 HN控制融合蛋白的机制。有趣的是，HN 与受体（α-连接唾液酸）的复合物尚未被捕获。只有唾液酸的 b-端基异构体，在 HN 活性位点中成像。 因此，尚不能排除 HN 与真实受体相互作用触发二聚体重排的可能性。
总之，人副流感病毒 III 型 HN 的神经氨酸酶活性位点显示出流感病毒神经氨酸酶中没有结构变异性。Y6 和 R1 中的构象变异很明显，这两个残基与酶活性有关。酶活性可能通过消除Y6/R1周围的作用丧失，这种构象异构体的形成可以产生受体结合位点。
