一、预测MT原蛋白结构
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访问AlphaFold3官网：打开网址https://alphafoldserver.com/。
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输入蛋白序列：在上图中红框所框出的位置中输入CAX1原蛋白序列。
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提交预测任务：输入完成后点击“Continue and preview job”，然后在弹出的对话框中选择“Confirm and submit job”。系统会自动进行蛋白质结构的预测。
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4.运行结束，点击样品前√就可以查看预测结果
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查看预测结果：预测完成后，可以点击查看预测结果。可以看到pTM为0.49，整体结构可信度还可以。
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下载结果：点击顶部的“Download”下载。最终可以得到如下文件，为了便于后面的比较，我们将fold_cax1_model_0重命名为MT.cif
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二、预测CAX1磷酸化修饰结构
- 选择修饰：输入CAX1原蛋白序列后，点击“+PTMs”
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在弹出的界面中选中想要选择修饰的氨基酸，例如38-41位的S
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然后下拉可以看到选择修饰的界面，选择“Phosphoserine”
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全部选择完毕后，点击“Save”，此时可以看到序列下方出现PTMs一栏。
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同时网页版也给出其他可选择的修饰类型，例如我们在这里选择K
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下拉后可以看到有一系列修饰类型：
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- 预测结构：按照前面所示操作预测结构后，我们可以得到如下结果
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- 下载结果：点击顶部的“Download”下载。最终可以得到如下文件，为了便于后面的比较，我们将fold_cax1_phos_model_0重命名为CAX1_phos。
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🌟 PyMOL结构比对
- 打开CAX1原结构：点击“File-Open”，打开前面所展示的CAX1结构文件
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- 打开CAX1翻译后修饰结构：点击“File-Open”，打开前面所展示的CAX1_phos结构文件
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- 蛋白结构比对：在命令框中输入如下比对命令，
align MT,WT
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从上图看到比对的整体情况，可以看到二者结构比较类似。同时软件给出RMSD值，由此可判断二者的结构存在区别。
- 展示氨基酸序列：点击“Display-Sequence”，展示两个蛋白的氨基酸序列。在这里我们可以看到CAX1中38-41位为S；CAX1_phos中38-41位为SEP，表示S发生磷酸化修饰
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- 放大点突位置：为了便于比较二者的结构，我们首先用鼠标选中两个蛋白在38-41位的氨基酸，此时可看到右侧出现“（sele）”一栏
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然后调整界面，放大发生修饰的氨基酸所在的位置，使其处于中央界面
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- 调整氨基酸颜色：首先用鼠标选中CAX1在38-41位的SSSS氨基酸，然后在“（sele）”一栏中左击“C”，选择“magentas- magenta”
[图片上传失败...(image-2660b4-1758779887880)] 然后用鼠标选中CAX1_phos在38-41位的SEP SEP SEP SEP氨基酸，然后在“（sele）”一栏中左击“C”，选择“reds-red”[图片上传失败...(image-e79a1e-1758779887880)]
最终可以看到发生磷酸化修饰和不发生修饰的氨基酸发生颜色变化，以及对应的结构变化。
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- 比较结构变化：从下面这张图中我们可以看到38-41位的S发生磷酸化修饰后α-helix位置发生了相对位移。而这种结构位移对CAX1结合离子起到重要的作用。
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参考文献：
Wang C, et al., Mechanisms of calcium homeostasis orchestrate plant growth and immunity. Nature. 2024
