又是周三，一周的黄金时间，因为疫情、父母隔离、工作的因素，最近写的少了，现在就是期望疫情早点过去，不要再限制我，躺平虽然很好，但是长期的躺平容易躺废~~~~，最后问大家一句，华大基因大家觉得怎么样？？

今天我们来研究一个很常见的问题，那就是在单细胞空间联合的时候，很多情况下我们并不能拿到匹配的单细胞空间数据，往往是只有空间数据，单细胞还要去其他文献中寻找，那么大多数情况下，单细胞空间数据就不是匹配的，这个时候，如果强行联合分析，可能会出问题，这个问题应当如何解决？这里，我给大家介绍一个方法，供大家参考。参考文章在spSeudoMap: Cell type mapping of spatial transcriptomics using unmatched single-cell RNA-seq data

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参考CellDART（这个可以参考我的文章10X单细胞-10X空间转录组联合分析之七----CellDART）单细胞空间联合的方法思路，更具体地说，定义了空间数据中唯一存在的细胞类型，称为伪类型。然后，通过参考空间和单细胞转录组来分配细胞混合物中假型的分数和表达谱。 混合物的其余部分充满了从单细胞数据中随机采样的细胞。 结果，联合分析了修饰的细胞混合物和空间转录组数据，以获得细胞亚群的空间图。

spSeudoMap: spatial mapping of the cell subpopulation transcriptome

为了估计亚群单细胞数据（例如分类或丰富的单细胞数据集）的细胞类型空间图，定义了包含空间数据中所有细胞类型的合成细胞混合物。它旨在创建一个与空间转录组高度相似的参考数据集。 对于每种混合物，分配了来自空间数据的专有细胞类型的比例，并创建了它们的合成基因表达谱。 其余的细胞混合物由单细胞数据生成。 该过程在 Scanpy (v.1.5.1) 和 Python (v.3.7) 中的 Numpy 中实现。

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首先，从具有随机权重的单细胞数据中随机抽取固定数量的细胞（n；brain：8 和breast：10）和细胞类型注释，并像使用 CellDART 一样创建名为 pseudospot 的细胞混合物。 进行了 Wilcoxon 秩和检验，并汇集了每种细胞类型的前 个标记。 通过提取与空间数据的总基因列表相交的基因来策划标记面板（基因总数：）。 对于每个pseudospot，计算标记组的复合基因表达谱。

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接下来，将空间数据中存在但单细胞数据中不存在的细胞类型进行聚合，并将该聚合命名为“伪类型”。 The pseudotype markers were speculated from pseudobulk analysis of both transcriptomes。 可以假设在空间数据中显示出比单细胞数据更大的pseudobulk表达的基因是pseudotype markers。 因此，每个基因的总计数除以总计数，并在两个数据集之间比较标准化计数。 空间数据与单细胞数据之间的归一化计数比率进行了 log2 转换，基因按 log 倍数变化的降序排序。 选择与单细胞簇标记不重叠的前k个基因作为假型标记，前20个基因用作假型分数的预测因子。 将单细胞和假型标记组合起来并命名为“composite marker panel”。

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然后，通过计算前 20 个pseudotype markers（Scanpy 中的 scanpy.tl.score_genes）的富集分数来估计空间数据中的pseudotype fraction。 根据对数归一化的表达水平，将空间数据的基因分为 25 个 bin。 对于每个标记基因，从同一箱中选择总共 50 个对照基因并汇集。 通过从pseudotype markers中减去对照基因库的平均表达来计算富集分数。 创建的模块分数的分布被缩放以具有给定的平均值（pseudof_m）和标准偏差（pseudof_std）。 大于 1 和小于 0 的值分别替换为 1 和 0。 假设两者之间存在线性关系，则按比例缩放的模块分数被认为是空间点的pseudotype fraction。

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To create a reference dataset, a pseudospot was aggregated to the pseudotype of a randomly chosen spot, and the combined gene expression for the composite marker panel was calculated。

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得到的细胞混合物被命名为修饰的pseudospot。 由于在pseudobulk 方法中根据log 倍数变化选择pseudotype markers，因此pseudotype中pseudotype markers的表达预计将显著高于单细胞标记。 此外，为简单起见，假设一个spot中所有pseudotype markers的表达与该spot的pseudotype中的表达成正比。 因此，修改后的pseudospot中的单细胞标记表达设置为0，并且通过将选定点的归一化计数乘以假定的pseudotype分数来分配pseudotype标记表达。

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最后，以假型与非假型的比例为权重，将pseudotype and the pseudospot的基因表达谱相加，得到修饰pseudospot的整合表达。

Exploration of an optimal parameter range

The key parameters for spSeudoMap are the number of markers per single-cell cluster (__), the ratio of the total number of single-cell to pseudotype markers ( ratio), and the mean and standard deviation of the pseudotype fraction in spatial spots (pseudof_m and pseudof_std). The performance of the spSeudoMap was tested across the various parameters in human DLPFC datasets (slide number: 151676). Since the proportion of 10 layer-specific excitatory neurons was 0.53 among the single-cell data, pseudof_m was set to 0.47. The cortical layer annotation in spatial data was used as a reference, and a layer discriminative accuracy of the predicted neuronal fraction was assessed by an area under the receiver operating characteristic curve (AUROC). In general, spSeudoMap was capable of stably predicting the spatial distribution of neuron subpopulations with a median AUC over 0.5 with N_markers larger than 20, larger than 1, and pseudo_std larger than 0.05. The corresponding parameter ranges were selected for the downstream analyses. For the human brain (slide 151673) and mouse brain tissues, N_markers was set to 80, the m/k ratio to 4, and pseudof_std to 0.1. In human breast cancer tissue, N_markers was set to 40, the ratio to 2 and pseudof_std to 0.1. Other parameters for the domain adaptation were given as the user guidelines of CellDART。

最后来看看示例代码

加载

import os

os.environ["CUDA_DEVICE_ORDER"] = "PCI_BUS_ID"
os.environ["CUDA_VISIBLE_DEVICES"]="0" # run on GPU
#run on CPU: os.environ["CUDA_VISIBLE_DEVICES"]="-1"

import scanpy as sc
import pandas as pd
import numpy as np
import seaborn as sns

Load example spatial data (10X Genomics: V1_Adult_Mouse_Brain_Coronal_Section_1)

sc.set_figure_params(facecolor="white", figsize=(8, 8))
sc.settings.verbosity = 3
if not os.path.exists: os.mkdir('./data')

# adata_spatial = sc.datasets.visium_sge(
#     sample_id="V1_Adult_Mouse_Brain_Coronal_Section_1"
# )
adata_spatial = sc.read_visium('./data/V1_Adult_Mouse_Brain_Coronal_Section_1/')

Load single-nucleus data (Mouse coronal section: Sanger institute)

import urllib.request as req

url = 'https://cell2location.cog.sanger.ac.uk/tutorial/mouse_brain_snrna/regression_model/RegressionGeneBackgroundCoverageTorch_65covariates_40532cells_12819genes/sc.h5ad'
req.urlretrieve(url, './data/adata_single.h5ad')
adata_single = sc.read('./data/adata_single.h5ad', cache=True)
adata_single = adata_single.raw.to_adata()

# Assign SYMBOL names to the index
adata_single.var.index = adata_single.var['SYMBOL']

Simulation of the subpopulation single-cell dataset: select the excitatory neuron types

adata_sc_sub = adata_single[adata_single.obs['annotation_1'].str.contains('Ext_')].copy()

Preparation of the parameters for the training

Optimal parameter choices
Number of marker genes per cluster: 40 (>20)
m/k ratio = 2 (> 1)
pseudo_frac_m = average fraction of negative non-sorted population (literature evidence or cell sorting experiment)
pseudo_frac_std = 0.1 (> 0.05)
Number of pseudospots = 5 to 10 times the number of real spots (20,000~40,000 per Visium slide)
Number of sampled cells in a pseudospot (virtual mixture of single-cell data) = 8 (brain), 10 (breast cancer)
Iteration number = 3,000
Mini-batch size = 512
Loss weights between source and domain classifier (alpha) = 0.6
Learning rate = 0.001 * alpha_lr = 0.005

# column name for single-cell annotation data in metadata(.obs)
celltype = 'annotation_1'
# number of selected marker genes in each cell-type
num_markers=40
# Total number of cell mixture (modified pseudospots) to generate
npseudo = adata_spatial.shape[0]*5
npseudo
# ratio of number of single-cell markers to virtual pseudotype markers
mk_ratio = 4
# Average of presumed fraction of the pseudotype (cell types exclusively present in spatial data) across all spatial spots
# -> Presumed average non-excitatory neuron fraction from simulation dataset
pseudo_frac_m = 1 - ((adata_sc_sub.shape[0])/(adata_single.shape[0]))
pseudo_frac_m
# pseudo_frac_std: standard deviation of the distribution of presumed pseudotype fraction across all spatial spots (default = 0.1)
pseudo_frac_std = 0.1
# Number of cells sampled from single-cell data when making a pseudospot
nmix = 8
# Output directory to save models and results
out_dir = './output'

######### Run spSEudoMap

# from spSeudoMap.pred_cellf_spSeudoMap import pred_cellf_spSeudoMap
from spSeudoMap.pred_cellf_spSeudoMap import pred_cellf_spSeudoMap
adata_spatial_cellf = pred_cellf_spSeudoMap(adata_sp=adata_spatial, adata_sc=adata_sc_sub, count_from_raw=False, 
                                            gpu=True, celltype=celltype, num_markers=num_markers,
                                            mixture_mode='pseudotype', seed_num=0, 
                                            mk_ratio_fix=True, mk_ratio=mk_ratio,
                                            pseudo_frac_m=pseudo_frac_m, pseudo_frac_std=pseudo_frac_std,
                                            nmix=nmix, npseudo=npseudo, alpha=0.6, alpha_lr=5, emb_dim=64, 
                                            batch_size=512, n_iterations=3000, init_train_epoch=10, 
                                            outdir=out_dir, return_format='anndata')

######### Load AnnData with predicted cell fraction data

adata = sc.read_h5ad(os.path.join(out_dir,'model','sp_data.h5ad'))
# Spatial composition of cell types
cell_types_interest = ['Ext_L25','Ext_L23','Ext_L56','Ext_L5_1',
                       'Ext_L6B','Ext_Hpc_CA1','Ext_Hpc_CA3',
                       'Ext_Hpc_DG1','Ext_Thal_1','Ext_Pir','Ext_Amy_1','Others']

for cell_type in cell_types_interest:
    sc.pl.spatial(adata, color=cell_type+'_cellf', size=1, color_map='jet')

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生活很好，有你更好