Cancer Cell | 单细胞分析肺癌细化肿瘤分类和患者分层

原创 骄阳似我 图灵基因 2021-12-09 19:05

收录于话题#前沿生物大数据分析

撰文：骄阳似我

IF：31.743

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亮点：

免疫治疗是非小细胞肺癌（NSCLC）治疗的主要手段。虽然肿瘤突变负荷（TMB）与免疫治疗反应相关，但对其与肿瘤基因型的关系知之甚少。本文作者使用单细胞RNA测序的方法，分析了35个早期NSCLC病变中的361929个细胞。发现了一个由PDCD1+CXCL13+激活的T细胞、IgG+浆细胞和SPP1+巨噬细胞的细胞模块，称为肺癌激活模块（LCAMhi）。作者在多个NSCLC队列中确认了LCAMhi的富集，并利用CITE-seq（细胞索引转录组和抗原决定簇测序）的方法建立了一个抗体小组来识别LCAMhi病变。发现LCAM的存在与整体免疫细胞含量无关，但与TMB、癌睾丸抗原和TP53突变相关。高基线LCAM评分与非小细胞肺癌患者对免疫治疗的反应增强相关TMB高于中位数，表明免疫细胞成分虽然与TMB相关，但可能是免疫治疗反应的非冗余生物标记物。

对于大多数转移性和局部晚期非小细胞肺癌患者来讲，针对PD-1/PD-L1轴的免疫检查点阻断技术是当前的一线治疗方案。在这个治疗方案上，虽然检查点阻断剂提高了患者的整体生存期，但大多数患者仍然可能经历身体的痛苦和经济的压力。这是由于我们对肿瘤相关免疫表型和检查点阻断反应的具体机制尚未清楚，因此在治疗方案中，难以确定最佳的生物标志物。

近期，在Cancer cell杂志上发表了一篇名为“Single-cell analysis of human non-small cell lung cancer lesions refines tumor classification and patient stratification”的文章，本文的研究人员通过scRNA-seq和CITE-seq技术对人非小细胞肺癌进行单细胞分析，研究了肿瘤突变负荷和TP53突变情况，构建了NSCLC肿瘤的细化分类以及患者分层的数据库，为免疫疗法的生物标记物的选择提供了重要的数据参考。

为了探讨肿瘤中免疫细胞的转录状态微环境，研究人员对未进行治疗的、早期的NSCLC患者体内的肿瘤进行切除并对细胞进行分析，生成了三个整合抗体分析的数据集.使用CITE-seq、scRNA-seq和T细胞受体测序（TCR-seq）对表面标记进行分析；对8名患者肿瘤和非肺部组织进行CITE-seq；对另外27名患者进行了scRNA-seq。CITE-seq包括15个抗体，用于验证基于RNA的细胞类型注释，并且在后续更具体的研究中，扩展到81种抗体。除此之外，研究人员对三名患者进行了scRNA-seq和TCR-seq的联合分析。使用算法对scRNA图谱进行聚类合并患者的数据。基于RNA的聚类分析在包括T细胞、B细胞、浆细胞、，肥大细胞、浆细胞样树突状细胞（PDC）和单核透明吞噬细胞（MNP）。总的来说，35个细胞中有361929个单细胞肿瘤和29例匹配的非肺部样本分为30例注释转录状态。在590和23812个单元格之间映射的簇，以及所有簇包括来自多个患者的细胞。研究人员检查了8例中每个肿瘤的3个区域的数据，将细胞映射到模型中。通过细胞类型的相关性对样本进行聚类分析，表明免疫细胞表型的差异主要是由肿瘤之间的差异而非区域取样差异造成的，这也验证了在研究中观察到的独特微环境，展示了观察到的肿瘤信号是强烈的和可复制的，于是进一步研究其中的转录状态差异与肿瘤分型之间的关系。图1.scRNA-seq和CITE-seq建立了肿瘤微环境中转录状态的多样性

富含调节分子的成熟DC的集群中包括cDC1，cDC2，DC3。研究人员通过scRNA-seq和CITE-seq解析，检测到肿瘤中cDC1的比例显著降低，因为成熟DC的激活模式对于诱导肿瘤导向T细胞反应，研究人员通过在单个玻片上对DC-LAMP和PD-L1进行多重免疫组织化学连续染色，结果表明编码基因的转录本在培养基中高度富集成熟DC簇，突出显示了在邻近的三级淋巴结构（TLS）中累积的细胞到T细胞。在统计学，TLS的CD3阴性区域上类似于淋巴结B细胞区，经常出现由MYH11+滤泡DC填充，这是一种常见于B细胞区的基质细胞类型。为了更好地理解DC3和其他MNPs，研究人员在CD14中寻找相互排斥的基因单核细胞、cDC2和单核细胞衍生的巨噬细胞，表明DC3存在于表型谱上在单核细胞样细胞和cDC2样细胞之间。而一些MoMF基因在DC3中的表达高于cDC2细胞。为了进一步揭示这些基因的可变转录程序DC3和cDC不依赖于特定的细胞分类，研究人员检测了所有受试者的可变基因之间的基因相关性。这种方法产生了一组跨细胞相关，独立于集群分配的共表达基因。图2.肿瘤内DC由扩张的DC3组成，并表达LCH样信号

MF中经典标记基因的表达可识别肺泡MF（AMF）、组织间MF（IMF）、CD14+和CD16+单核细胞、MoMF和AZU1+的种群+MF。为了评估IMF是否可以进一步细分，研究人员使用报道的前50个基因来区分CX3CR1+和LYVE1 ，结果显示不相关（r=0.09；p=9.0310 9)，确认沿轴的多样性，但表明scRNA水平上的整体弱信号。通过检测MoMF中基因模块的表达模式，研究人员发现将MoMF集群分为I–IV子类型：MoMF II集群表达最高水平的富含肿瘤的mod2。包括SPP1和糖酵解基因（GAPDH、ENO1、LDHA、AL DOA、TPI1），以及较低水平的C1Q和HLA II类转录本（mod4和mod46）。MoMF III在mod11中得到了丰富（包括TREM2和LILRB4）和mod14（包括APOE和GPNMB）。当AMF耗尽且IMF频率稳定时。单核细胞频率也可能降低。可能反映了MoMF或DC3的分化。鉴于nLung和tumor之间的MoMF亚群变化不同此外，研究人员还了解了这些差异与MoMF之间潜在的异质性之间的关系，以及这些差异所揭示的特征模块分析。高表达基因编码分泌型各MNP之间的因子表现出明显差异。MoMF II表达最高水平的炎症反应细胞因子TNF和IL6、编码多效性因子SPP1、多种基质金属肽酶和CCR2/5的转录本配体CCL-2、-8和-7，而其他MoMF群体则表现出不太明显的分泌谱。多个MNP表达CXCR3配体趋化因子CXCL-9，-10，和-11，包括MoMF、DC3和mregDC。mregDC表达与T细胞相关的细胞因子和趋化因子，包括IL12B、EBI3、CCL17、CCL22、，和CCL19。图3.肿瘤排除AMF，并表现出MoMF的多样性。

为了确定可能驱动患者多样性的细胞表型之间的关系，研究人员将各种谱系的细胞类型频率进行了相关性分析，发现了T免疫球蛋白浆细胞和MoMF-II，研究人员将此称为肺癌激活模块，与LCAM最相关的细胞类型，B细胞，TCM，AMF，Cdc1，cdc2，AZU1+MF。根据这些细胞类型的几何平均值对患者进行排序，进行分层。这种分层与谱系频率和LCAM的变化没有很强的相关性，谱系变化与肿瘤总体一致，包括NK细胞较少，B细胞和浆细胞较多。为了验证LCAM分层在一个独立队列中是否具有可重复性，使用基于CITE-seq分析的标记，研究人员开发了一个cYTOF面板，通过门控来模拟LCAM群体的变化，并借助该工具分析了另外6位患者的肿瘤。图4.患者沿LCAM轴分层

为了找出集成LCAM评分是否与特定基质人群相关，研究人员从8个NSCLC患者公共数据中集中获取了针对特定个体人群的基因列表，并使用这些数据量化分析，结果证实，整体LCAM评分与癌相关成纤维细胞（CAF）相关，与正常成纤维细胞相关，并与这些评分的差异密切相关，同时它与淋巴或血液内皮细胞之间的相关性较弱或不存在相关性。这些数据表明LCAM与CAF之间的相关性。TMB是免疫反应检查点相应最可靠的预测因子之一，同时与集成LCAM相关。为了识别可能影响集合LCAM评分超越TMB的特征，研究人员集合LCAM评分回归到logTMB上，并将候选变量与残差关联起来，从而基于这种量化关系观察LCAM与预期的差异性，量化预测的总抗原与这些残差不相关，反而与总癌睾丸抗原相关。总的来说，通过scRNA-seq对列，表明LCAM模块的表达是对突变和肿瘤适应性反应的标志。图5.与LCAM相关的肿瘤特征。

本文通过对35例NSCLC患者的肿瘤和非肺部组织进行scRNA-seq和CITE-seq分析，建立了迄今为止最大的早期肺癌免疫反应的scRNA图，并进一步统一了细胞分类的高维模型。通过集成公共数据并利用CITE-seq来设计检测抗体，证实了体系的可重复性，通过对其中免疫细胞类型的分析建立了对NSCLC肿瘤进行详细分型的LCAM模块，说明LCAM可以作为更直接的衡量抗原特异性抗肿瘤免疫激活的指标，这项研究对免疫治疗过程中最佳标志物的选择提供了坚实的数据支持。

教授介绍：

Ephraim Kenigsberg

Ephraim Kenigsberg是美国西奈山伊坎医学院遗传学和基因组科学系博士，助理教授。在计算与实验结合方向有独特的经验，在知名杂志发表论文40余篇，其主要研究方向为利用高通量测序、遗传学、免疫学、系统生物学的角度对人类疾病以及精准医疗开展研究研发。

参考文献：

Andrew M. Leader, et al. Single-cell analysis of human non-small celllung cancer lesions refines tumor classification and patient stratification [J].Cancer Cell. 2021 Nov 11:S1535-6108(21)00560-2