Nat Cancer | 三维成像质谱仪用于组织和肿瘤微环境的批量分子和细胞定位

原创 楠烟不可言 图灵基因 2022-01-30 09:20

收录于话题#前沿分子生物学技术

撰文：楠烟不可言

Nature新子刊

推荐度：⭐⭐⭐⭐⭐

亮点：

本文报告了在单细胞分辨率下用于多路三维组织分析的3D IMC的发展，并通过分析人类乳腺癌样本证明了该技术的实用性。由此产生的三维模型揭示了细胞和微环境的异质性以及在二维中无法检测到的细胞水平的组织结构。3D IMC在3D空间中发生的现象（如肿瘤细胞入侵过程）的研究中证明其强大功能，并有望为细胞微环境和组织结构提供新的见解。

近日由苏黎世大学Bernd Bodenmiller研究组《Nature Cancer》杂志上分别发表了名为“Three-dimensional imaging mass cytometry for highly multiplexed molecular and cellular mapping of tissues and the tumor microenvironment”的研究文章。要全面了解组织和器官的结构和功能，需要在其原始三维（3D）环境中检测分子成分。成像质量流式细胞术（IMC）能够使用金属标记抗体同时检测多达40种抗原和转录物，但迄今为止仅限于二维成像。这篇文章报告了在单细胞分辨率下用于多路三维组织分析的3D IMC的发展，并通过分析人类乳腺癌样本证明了该技术的实用性。由此产生的三维模型揭示了细胞和微环境的异质性以及在二维中无法检测到的细胞水平的组织结构。

组织和器官是复杂的，由许多细胞类型组成，这些细胞类型以与功能密不可分的方式排列。因此，了解组织功能和病理学需要了解组成细胞及其状态、细胞外基质蛋白和脉管系统应在其3D结构下进行。最近开发的方法可以进行各种类型的 3D 组织分析，共聚焦3D 显微镜能够以亚细胞分辨率分析组织切片，但仅限于约 100 µm的深度。多光子共聚焦和光片显微镜允许以单细胞分辨率进行组织深度高达 1 mm的 3D 重建，但这些3D 显微镜方法依赖于显示高光谱重叠的荧光报告基因，因此可以同时测量的表位数量是有限的。这篇文章报道了3D IMC，这种方法从样品处理到完整3D模型的单元级计算分析的完整流程可在1周内完成。同时研究展示了3D IMC如何通过结合组织体积分析和单细胞信息来研究肿瘤结构。研究结果表明，在3D模型中，标记表达的空间异质性和优先细胞-细胞相互作用变得明显，并且可以在单个3D模型中捕获空间上包含的事件。总之，这一研究证明了3D IMC生成的详细模型有助于对细胞微环境和组织结构进行全面的单细胞分辨率分析。

研究人员首先改进了样品处理方法，使用带有金刚石刀的超薄切片机进行石蜡切片，以最大程度地减少已知在组织切割、薄片处理和进一步实验程序期间引起的变形。组织切片之后进行组织水合和热诱导的表位修复。在获取二维 (2D) IMC 数据后，研究人员对3D 组织模型进行组装并使用基于公开可用工具建立的计算工作流程导出单细胞标记图谱（图1a）。3D IMC 方法能够在 3D 组织结构的背景下研究大约 40 个表位的空间分布。为了举例说明 3D IMC 工作流程，研究从不同的乳腺癌样本中重建了 3D 模型。研究人员使用了 HER2 +导管乳腺癌样本，从组织样本中切下 152 个连续切片，并用以乳腺癌为中心的抗体组对切片进行染色，旨在揭示基底细胞和管腔细胞、血管化、免疫细胞浸润、增殖、细胞凋亡、缺氧、细胞信号传导和胶原蛋白沉积的情况。在整个分析体积中，基质区室的细胞组成似乎是异质的，表达常见的免疫细胞标志物，包括CD20、CD8a、CD3 和 CD68。因此，使用 3D IMC，可以通过评估原始体素级数据的分布来分析整个组织体积中多个标记的空间排列（图1）。

为了更深入地研究肿瘤生态系统，研究分割了从图像的重叠区域提取单细胞信息，为每个细胞分配一个唯一的标识符，用于计算每个细胞的抗体信号统计和空间数据（例如体积和直接相邻相互作用）。使用抗体信号统计（以下称为标记表达）计算为抗体面板中每个通道的每个单细胞3D掩模上离子计数的平均强度。随后研究人员对铱染色的核通道进行了分割，通过将单细胞掩模与铱信号叠加，目视评估分割结果（图2）。

为了评估单细胞的衍生标记表达是否捕获预期的生物学信息并与原始体素数据相符，研究人员使用Phenograph 聚类来为每个单细胞分配细胞表型。研究人员选择小组中的抗体以识别已知的肿瘤、免疫和基质细胞表型。我们根据关键标志物的差异表达确定了预期的细胞表型，例如 panCK 阳性的上皮细胞（如簇 1-7 和 10-13）、胶原和 SMA 阳性的基质细胞（簇 17 和 22）、B 细胞阳性CD20 和 CD45（第 25组），CD8a、CD3 和 CD45 阳性的 T 细胞（第 18 组），CD68 和 CD45 阳性的巨噬细胞（第 30 组）以及血管性血友病因子 (vWF) 和 CD31 阳性的内皮细胞（第 21组）。通过3D数据，研究很容易看到不同细胞表型的位置，例如观察到 CD45 + CD3+ T 细胞（簇 13 和 18）聚集在 vWF + CD31 +内皮细胞（簇21）。这些不同的模式在 2D 中将更难以识别。除了通过聚类基于聚合的标记表达为每个细胞分配其表型外，这一方法还可以使用表达式掩码评估每个单个细胞的平均抗体信号统计及其空间位置，其中每个细胞的每个体素都分配有派生的标记表达价值。研究人员观察到该模型中的肿瘤细胞显示出不同的管腔细胞标志物（细胞角蛋白 8/18 和 19）、基底细胞标志物（细胞角蛋白 5 和 SMA）和其他乳腺癌上皮标志物如 HER2 和 CD44 的表达水平。这些分析表明，3D IMC 能够详细分析 3D 组织环境中的预期细胞表型，并识别组织体积内位置不同的细胞群（图3）。

由于组织是 3D 结构，研究人员预计 3D 中距离和细胞间接近度的测量应该比 2D IMC更好地捕获建模组织。研究通过比较从上述主要 HER2 阳性导管乳腺癌样本中获得的数据中的各种定量测量来评估这一点。研究首先测量了不同细胞表型之间的距离，通过初始聚类步骤和所有 2D 切片和重建的 3D 模型中最近的血管确定。在 3D 中不同细胞表型到最近血管的平均距离总是比在 2D 中测量的要短。这与预期一致，因为在单个 2D平面中无法检测到平面上方和下方的特征。与 2D 图像相比，3D 模型对细胞和微环境关系的测量在数量上有所不同，并且考虑到 3D 组织结构，这些差异是预期的或合理的（图4）。

研究还推断 3D 模型将揭示在 2D 图像上可能不可见的蛋白质表达的空间排列。在主要HER2 +导管乳腺癌 3D 模型中，可在基底层观察到 panCK +管腔区域和斑片状和不连续模式的细胞角蛋白 5 (CK5)，尽管另一种基底标记物 SMA均匀表达。斑驳的基底层仅在 3D 重建中清晰可见，在2D图像中不可见。研究结果说明空间细胞级组织结构在 3D中变得明显，强调了我们研究组织结构的方法的价值（图5）。

3D 重建在分析通过 3D 空间进行的现象时可能特别强大。HER2 +导管乳腺癌 3D 模型的重建揭示了一种可能类似于微侵袭性病变和潜在侵袭性肿瘤细胞流的结构。肿瘤的远端部分（沿z轴深度达 80 µm ）不含推定的侵入细胞，肿瘤细胞室具有平滑的肿瘤-基质边界。朝向肿瘤中心（沿 z 轴约 120 µm 的深度）并通过近端区域（160 µm 和更深），检测到可能从微突起中出现的假定侵袭性 panCK +上皮细胞。在 3D 模型中，这些潜在的侵袭性细胞可以有把握地与大块肿瘤块区分开来，因为可以确定给定的上皮细胞簇是否与肿瘤网络完全断开（图6）。

总而言之，该研究展示了一种用于 FFPE 组织的多路复用、单细胞分辨率、3D 分析策略。3D IMC 将能够在任何组织类型的天然组织结构的背景下对细胞谱系和通信机制进行详细的可视化和分析。3D IMC 方法推进了在 3D 组织结构背景下对蛋白质空间分布的研究。

教授介绍

Bernd Bodenmiller，苏黎世大学定量生物医学系教授，主要研究方向是开发实验和计算方法，以解开作为癌症发展基础的单细胞水平的调节系统。目标是开发基于CyTOF 质谱流式细胞仪的方法来定量分析跨细胞电路。基于大量细胞术数据，我们建模和分析如何控制肿瘤中复杂的细胞表型。

参考文献

1、Laura Kuett, Raúl Catena, Alaz Özcan et al. Three-dimensional imagingmass cytometry for highly multiplexed molecular and cellular mapping of tissuesand the tumor microenvironment (2021).https://www.nature.com/articles/s43018-021-00301-w