摘要
优化绵羊诱导多能干细胞（iPSC）的电穿孔转染效率。通过系统调整电压、脉冲时间及质粒浓度，结合威尼德电穿孔仪的参数设置，筛选出转染效率与细胞存活率的最优组合。实验结果显示，电压300 V、脉冲时长5 ms、质粒浓度2 μg/μL时，转染效率达68.2%，细胞存活率>80%。本方案为绵羊iPSC基因编辑研究提供了可靠的技术支持。
引言
绵羊诱导多能干细胞在畜牧育种、疾病模型构建及转基因动物开发中具有重要应用价值。然而，其转染效率受限于细胞膜通透性低及传统转染方法（如脂质体）的毒性问题。电穿孔技术通过瞬时电脉冲形成膜孔道，可高效递送外源基因，但参数设置需根据细胞类型精准优化。本研究针对绵羊iPSC特性，采用威尼德电穿孔仪，探究电压、脉冲时间及质粒浓度对转染效率的影响，建立标准化操作流程，以期为后续基因功能研究提供技术基础。
实验部分
1. 材料与仪器
细胞来源：绵羊耳缘成纤维细胞重编程获得的iPSC系，培养于含某试剂（基础培养基）的体系中。
质粒构建：携带绿色荧光蛋白（GFP）及嘌呤霉素抗性基因的pCXLE载体。
核心仪器：威尼德电穿孔仪、威尼德紫外交联仪、倒置荧光显微镜（某品牌）。
2. 实验方法
2.1 细胞培养与预处理
iPSC以某试剂（含10%胎牛血清的DMEM/F12培养基）培养，传代至对数生长期后，用0.25%胰酶消化制备单细胞悬液（密度1×10^6 cells/mL），预冷至4℃备用。
2.2 电穿孔参数设计
采用三因素三水平正交实验：
电压梯度：250 V、300 V、350 V
脉冲时间：3 ms、5 ms、7 ms
质粒浓度：1 μg/μL、2 μg/μL、3 μg/μL
每组重复3次，转染后细胞接种于24孔板，37℃、5% CO₂条件下恢复培养24 h。
2.3 转染效率检测
荧光显微镜观察：威尼德紫外交联仪固定细胞后，通过GFP阳性细胞比例计算转染效率。
流式细胞术：收集细胞悬液，某试剂（PI染色液）标记死细胞，分析存活率。
2.4 数据统计
采用某软件（SPSS 26.0）进行方差分析，显著性水平设为P<0.05。
结果与讨论
1. 电压对转染效率的影响
电压300 V时，转染效率达峰值（68.2%±3.1%），显著高于250 V（45.7%±2.8%）与350 V（52.4%±4.2%）。高电压（350 V）虽增加膜通透性，但导致细胞存活率下降至62.5%（P<0.01），提示电压需平衡转染效率与细胞活性。
2. 脉冲时间与质粒浓度的协同效应
脉冲时间5 ms时，质粒浓度2 μg/μL的组合可显著提高DNA导入量（荧光强度较1 μg/μL组提升1.8倍），而浓度超过3 μg/μL则引发细胞毒性（存活率<70%）。威尼德电穿孔仪的多脉冲模式（2次间隔100 ms）进一步降低热损伤风险。
3. 正交实验优化结果
综合极差分析表明，电压为关键影响因素（贡献率42.3%），其次为质粒浓度（31.5%）与脉冲时间（26.2%）。最优参数组合（300 V、5 ms、2 μg/μL）下，转染效率与存活率均显著优于常规方案（P<0.05）。
结论
本研究成功建立了适用于绵羊iPSC的高效电穿孔转染体系，证实威尼德电穿孔仪可通过参数精细化调控实现基因递送效率与细胞活性的双重优化。该方案为绵羊干细胞基因编辑及功能研究提供了重要技术支撑。
技术细节补充
电穿孔缓冲液：采用某试剂（低电导率缓冲液），减少电流热效应。
质粒纯度要求：A260/A280比值1.8-2.0，威尼德分子杂交仪验证无蛋白残留。
质量控制：每批次实验前使用标准质粒进行仪器校准，确保参数稳定性。
参考文献
1.马玉珍,王瑞,闫真,等.LipofectamineTM和Fugene-6介导GFP基因转染绵羊胎儿成纤维细胞的比较研究[J].中国农业科技导报.2008,(1).DOI:10.3969/j.issn.1008-0864.2008.01.019 .
2.王海,陆泉枝,连正兴,等.电穿孔导入绿色荧光蛋白基因于绵羊胎儿成纤维细胞研究[J].中国畜牧杂志.2004,(2).DOI:10.3969/j.issn.0258-7033.2004.02.003 .
3.钱锋,肖成组.影响细胞电穿孔效率的因素[J].生物技术.1998,(5).27-31.
4.Wu,Y.,Guo,Z.,Zhang,Y.,等.Vitamin C enhances nanog expression via activation of the JAK/STAT signaling pathway[J].Stem Cells.2014,32(1).
5.Leonardo, Chicaybam,Andressa Laino, Sodre,Bianca Azevedo, Curzio,等.An efficient low cost method for gene transfer to T lymphocytes.[J].PloS one.2013,8(3).e60298.
6.Weng Z,Pei D,Wolbank S,等.Vitamin C enhances the generation of mouse and human induced pluripotent stem cells.[J].Cell stem cell.2010,6(1).
