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非酒精性脂肪性肝炎（nonalcoholic steatohepatitis，NASH）是一种慢性肝脏疾病，其特征是肝脏中脂肪积累、炎症和纤维化。干扰素基因刺激因子（stimulator of IFN genes，STING）是一种细胞质DNA传感器，与NASH中的炎症激活有关。先天免疫激活对于NASH进展期间引发肝脏炎症至关重要，然而免疫调节分子如何识别脂肪生成、纤维化和炎症信号的机制尚不清楚。

2024年8月9日，上海交通大学医学院附属仁济医院肝脏外科徐东伟博士、Xiaoye Qu、Tao Yang为并列第一作者，徐东伟博士和美国加州大学洛杉矶分校大卫格芬医学院Bibo Ke为共同通讯作者研究了高脂饮食（high-fat diet，HFD）诱导的氧化应激如何激活肝细胞中的Foxo1、YAP和Notch1信号，并研究这些信号如何影响NASH进展。相关研究成果以“The Foxo1-YAP-Notch1 axis reprograms STING-mediated innate immunity in NASH progression”为题发表在《experimental and molecular medicine》杂志（EXP MOL MED）（IF 9.5）。

本研究揭示高脂饮食（HFD）诱导的氧化应激激活了肝巨噬细胞中的Foxo1、YAP和Notch1信号。巨噬细胞Foxo1缺失（Foxo1M-KO）改善了HFD肝脏中的肝炎、脂肪肝和纤维化，减少了HFD肝脏中STING（stimulator of IFN genes）、TBK1（TANK-binding kinase 1）和NF-κB的激活。但Foxo1和YAP双基因敲除（Foxo1/YAPM-DKO）或Foxo1和Notch1双基因敲除（Foxo1/Notch1M-DKO）促进了STING功能，并加剧HFD诱导的肝损伤。而Foxo1M-KO显著降低了棕榈酸（PA）和油酸（OA）刺激的Kupffer细胞释放的TGF-β1，并在与Kupffer细胞共培养后的原代肝星状细胞（HSCs）中介导Col1α1、CCL2和Timp1表达下调，但上调MMP1表达。Kupffer细胞中PA和OA增强了LIMD1和LATS1的共定位和互作，从而诱导YAP核转位。Foxo1M-KO激活了PGC-1α并增加了细胞核YAP活性，调节线粒体生物合成。研究利用染色质免疫沉淀测序（ChIP-Seq）以及原位RNA杂交，揭示了NICD与YAP共定位并靶向Mb21d1（cGAS），而YAP作为NICD的新辅助激活因子，对于NASH进展中STING功能的重编程至关重要。这些发现强调了巨噬细胞Foxo1–YAP–Notch1轴作为一个关键分子调控因子的重要性，该轴可以调控NASH中的脂质代谢、炎症和先天免疫。

实验方法：

使用基因敲除小鼠模型，通过24周高脂饮食喂养后，利用ChIP-seq、RNA-seq、RNA原位杂交、Western blot等方法研究了Foxo1、YAP和Notch1在巨噬细胞中的特异性敲除对肝脏病理变化的影响。

结果图形：

（1）巨噬细胞中Foxo1敲除减少高脂饮食（HFD）诱导的肝脏脂肪变性和炎症反应。

为鉴定巨噬细胞Foxo1是否参与肝脏脂肪变性，研究分析了脂肪肝中Kupffer细胞的Foxo1表达。通过Western

blot、免疫荧光染色、组织学染色、定量PCR等实验研究结果表明，巨噬细胞中Foxo1缺失可以减少高脂饮食诱导的脂肪变性和炎症反应。Foxo1在调控肝脏脂肪积累和炎症过程中的作用表明巨噬细胞Foxo1在NASH的发生和发展中起着至关重要的作用，而调节Foxo1活性或表达可能为治疗NASH提供一种新策略。

图1：巨噬细胞Foxo1缺失减少了高脂饮食诱导的NASH中的肝脏脂肪变性和炎症。 a. 在野生型（WT）小鼠被喂食高脂饮食（HFD）24周后，通过western blot分析揭示肝脏巨噬细胞中的核Foxo1、p-JNK、JNK、p-P65和P65蛋白表达上调。 b. 免疫荧光染色显示脂肪肝中巨噬细胞Foxo1表达增加（每组n=6个样本）。 c. Foxo1M-KO小鼠表现出较低的肝脏与体重比（每组n=6个样本）。 d. Foxo1M-KO肝脏中肝甘油三酯（TG）和总胆固醇（TC）水平（每组n=6个样本）降低。 e. 代表性的组织学染色（H&E和Oil Red O）显示Foxo1M-KO减轻肝脏脂肪变性，并减少肝细胞气球样变和脂质积累（每组n=6个样本）。 f. 基于组织学图像检测的NAS（NAFLD活动评分）在Foxo1M-KO组中显著降低（每组n=6个样本）。 g. HFD喂养的Foxo1M-KO小鼠血清ALT和AST水平降低（IU/L）（每组n=6个样本）。 h. 定量PCR显示，脂肪肝中负责脂肪酸摄取和合成的基因Srebp1c、Slc27a1、Fabp1、CD36、Fas和Accα的水平显著降低，而Cpt1α、Acox1和Acadm表达增加（每组n=6个样本）。

（2）巨噬细胞Foxo1缺失抑制了 STING 介导的HFD型NASH肝脏炎症和纤维化

接下来研究人员分析了巨噬细胞 Foxo1 是否影响 HFD 诱导NASH中的 STING 激活和肝纤维化。数据结果表明，巨噬细胞Foxo1信号对于调控HFD诱导的NASH中STING介导的肝脏炎症和纤维化至关重要。

图2：巨噬细胞中Foxo1敲除抑制了HFD诱导的NASH中STING介导的肝脏炎症和纤维化。 a. 在Foxo1M-KO小鼠经过24周的HFD喂养后，肝脏中p-STING、p-TBK1和p-P65的表达减少。 b. 免疫荧光染色显示，在Foxo1M-KO小鼠经过24周的HFD喂养后，肝脏中CD11b阳性巨噬细胞减少（每组n=6个样本）。 c. 定量RT-PCR显示，在Foxo1M-KO小鼠经过24周的HFD喂养后，TNF-α、IL-1β、IL-6和CXCL-10水平降低，而IL-10的水平在Foxo1M-KO小鼠中增加（每组n=6个样本）。 d. 代表性的组织学和免疫组化染色（Sirius Red、Masson和α-SMA）显示Foxo1M-KO小鼠的HFD肝脏中肝纤维化减少（每组n=6个样本）。 e. 定量RT-PCR显示脂肪肝中Foxo1M-KO小鼠的α-SMA、Col1a1、CCL2和Timp1表达减少（每组n=6个样本）。 f. 肝脏Kupffer细胞先用0.2 mM棕榈酸（PA）和0.4 mM油酸（OA）混合物刺激24小时，然后与原代肝星状细胞（HSCs）共培养。与Foxo1FL/FL相比，Foxo1M-KO显著减少了PA/OA刺激的巨噬细胞在共培养上清中TGF-β1的释放（每组n=4个样本）。 g. 共培养后发现HSC水平的Col1α1、CCL2、Timp1 mRNA减少，MMP1增加（每组n=4个样本）。

（3）巨噬细胞Foxo1敲除促进Notch1和Hippo信号通路响应HFD

接下来，作者研究了巨噬细胞Foxo1是否影响对响应HFD的基因表达和信号通路。对照组Foxo1FL/FL和敲除组Foxo1M-KO小鼠经过24周HFD喂养后，从小鼠中分离出肝脏巨噬细胞，并进行深度RNA测序（RNA-seq）分析。分析结果表明，与Foxo1FL/FL对照组相比，Foxo1M-KO组HFD巨噬细胞中912个基因表达发生显著变化（415个上调和497个下调）（图3a）。GO分析显示Foxo1M-KO中与炎症反应、先天免疫反应、细胞脂质代谢过程等多个基因表达发生变化（图3b，c）。KEGG分析揭示了与Notch信号通路、脂肪酸代谢、PPAR信号通路、AMPK信号通路、Hippo信号通路及细胞因子-细胞因子受体互作相关的基因表达的富集（图3d，e）。Notch1和Hippo信号通路相关基因，如Hes1、Hey1、Fosl1、Ccnd1、Nr4a2、Ccnb1和Erbb2，在HFD喂养的Foxo1M-KO动物的巨噬细胞中显著激活，且通过定量RT-PCR进一步验证。这些结果表明Notch1和Hippo通路在调节巨噬细胞Foxo1驱动的NASH进展中发挥着重要作用。

图3：巨噬细胞中Foxo1敲除在响应高脂饮食（HFD）时促进了Notch1和Hippo信号通路。Foxo1FL/FL和Foxo1M-KO小鼠经过24周HFD喂养后，从它们的肝脏巨噬细胞中提取了总RNA，随后进行RNA-seq。 a. Foxo1M-KO小鼠与Foxo1FL/FL对照组相比，在HFD肝脏巨噬细胞中的基因表达的log2倍数变化。HFD肝脏巨噬细胞中的差异表达基因（DEGs）（n=912，P<0.05）被标记出来（红色表示上调，n=415；绿色表示下调，n=497）。 b-c. Foxo1M-KO小鼠的HFD肝脏巨噬细胞的GO富集分析，包括细胞成分和生物过程。 d. KEGG通路富集分析，分析了Foxo1M-KO小鼠的HFD肝脏巨噬细胞中差异表达的转录本。 e. Foxo1M-KO小鼠的HFD肝脏巨噬细胞中表达变化的基因热图。

（4）巨噬细胞Foxo1敲除在HFD诱导的氧化应激中增加了YAP/NICD活性并抑制STING激活

由于Hippo通路及其效应蛋白YAP（一个转录辅激活因子），已被确认为调控基因功能的重要信号级联，作者随后研究了HFD诱导的氧化应激是否影响NASH进展中的YAP和Notch1的细胞内域（NICD）。

图4：巨噬细胞中Foxo1敲除在HFD诱导的氧化应激中增加了YAP/NICD活性并抑制STING激活。 a. HFD喂养后，巨噬细胞中的核YAP和NICD表达显著增加。 b. 从WT小鼠中分离的肝脏巨噬细胞用0.2 mM棕榈酸（PA）和0.4 mM油酸（OA）混合物刺激24小时。PA/OA刺激激活了JNK，并增加了巨噬细胞中核Foxo1和PGC-1α的表达。 c. PA和OA刺激增加了p-LATS1和LIMD1表达，导致巨噬细胞中细胞质YAP磷酸化减少和核YAP表达增加。 d. 免疫荧光染色显示PA/OA刺激的巨噬细胞中巨噬细胞LIMD1（绿色）和LATS1（红色）的共定位。 e. 免疫共沉淀分析显示PA/OA刺激增强了巨噬细胞中LIMD1和LATS1的共定位和互作。 f. WT小鼠的肝脏巨噬细胞在PA/OA刺激后转染CRISPR/Cas9介导的LIMD1 KO或对照载体。此外LIMD1 KO增加了细胞质YAP磷酸化并减少核YAP表达。 g. 巨噬细胞Foxo1敲除显著增加了PGC-1α、YAP和NICD水平，并在PA/OA刺激后下调p-STING表达。 h. Foxo1M-KO小鼠的肝脏巨噬细胞在PA/OA刺激后转染CRISPR/Cas9介导的PGC-1α KO或对照载体。免疫共沉淀分析揭示Foxo1M-KO细胞中CRISPR/Cas9介导的PGC-1α KO减少了YAP与NICD互作并增加p-STING表达。

（5）YAP-NICD互作靶向cGAS并调节STING介导的炎症

HFD诱导的氧化应激增加了JNK依赖性Foxo1转录活性和LIMD1介导的YAP核转位，并激活Notch1信号，作者进一步研究其中的潜在分子机制。

图 5：YAP–NICD互作靶向cGAS并调节STING介导的炎症。 a. 免疫荧光染色显示，在PA/OA刺激后巨噬细胞核内YAP（绿色）和NICD（红色）的共定位。 b. 免疫共沉淀分析显示，Foxo1敲除增加了YAP与Foxo1M-KO巨噬细胞中NICD的结合。 c. NICD ChIP-seq分析的实验设计。骨髓源性巨噬细胞（bone marrow-derived macrophages，BMMs）在与PA/OA共培养24小时后收集并固定。在染色质剪切和NICD抗体选择后，沉淀的DNA片段由NICD蛋白复合物进行测序。 d. 在小鼠Mb21d1（cGAS）基因上的NICD结合位点的定位。显示了9号染色体上小鼠cGAS基因的5个外显子、4个内含子、3'非翻译区（UTR）、5'UTR和转录起始位点（TSS）。 e. NICD和YAP与cGAS启动子结合的ChIP-PCR分析。 f. RNA原位杂交分析显示，在PA/OA刺激后Foxo1FL/FL巨噬细胞中目标基因cGAS的转录表达增加（每组n=4个样本）。 g. 脂肪酸刺激增加了Foxo1FL/FL或Foxo1M-KO小鼠的PA刺激的Foxo1FL/FL巨噬细胞中cGAS、p-STING、p-TBK1和p-P65的表达，而Foxo1敲除减少了cGAS、p-STING、p-TBK1和p-P65的表达。 h. qRT-PCR分析显示，在暴露于PA/OA的巨噬细胞中TNF-α、IL-1β、IL-6和CXCL-10水平降低（每组n=4个样本）。 ChIP-seq分析揭示了YAP–NICD轴靶向cGAS并调节对PA/OA刺激的STING介导的炎症反应。

（6）HFD诱导的NASH中巨噬细胞Notch1信号通路破坏激活了cGAS并增加STING介导的肝脏炎症和纤维化。

为了阐明Notch激活在巨噬细胞Foxo1信号介导的NASH免疫调节中的作用机制，作者制备了骨髓特异性Foxo1和Notch1双敲除（Foxo1/Notch1M-DKO）小鼠。

图6：巨噬细胞Notch1信号通路的破坏激活了cGAS并增加了HFD诱导的NASH中STING介导的肝脏炎症和纤维化。 a. 24周HFD喂养后，Foxo1/Notch1M-DKO增加了脂肪肝中cGAS、p-STING、p-TBK1、p-P65以及核PGC-1α、LIMD1和YAP的表达。 b. 免疫荧光染色显示Foxo1/Notch1M-DKO增加了脂肪肝中CD11b阳性巨噬细胞的积累（每组n=6个样本）。 c. Foxo1/Notch1M-DKO增加了脂肪肝中TNF-α、IL-1β、IL-6和CXCL-10的表达，并降低了IL-10水平（每组n=6个样本）。 d. HFD喂养的Foxo1/Notch1M-DKO小鼠的肝脏/体重比显著增加（每组n=6个样本）。 e.  HFD喂养的Foxo1/Notch1M-DKO小鼠的TG和TC（mg/g）脂质水平显著增加（每组n=6个样本）。 f. 代表性组织学染色（H&E和Oil Red O）显示HFD喂养的Foxo1/Notch1M-DKO小鼠的肝脏表现出增加的脂质积累（每组n=6个样本）。 g. 基于组织学图像检测的NAS（NAFLD活动评分）在Foxo1/Notch1M-DKO组显著增加（每组n=6个样本）。 h. HFD喂养的Foxo1/Notch1M-DKO小鼠的血清ALT和AST水平增加（IU/L）（每组n=6个样本）。 i. 代表性的组织学和免疫组化染色（Sirius Red和Masson）显示Foxo1/Notch1M-DKO小鼠的脂肪肝组织中肝纤维化增强（每组n=6个样本）。 j. 在HFD喂养后，Foxo1/Notch1M-DKO肝脏中包括αSMA、Col1α1、TGF-β1、CCL2和TIMP1在内的促纤维化基因的mRNA表达增加（每组n=6个样本）。 Foxo1/Notch1M-DKO激活了cGAS，增加了STING介导的炎症反应，并加剧了HFD诱导的NASH中的肝纤维化。

（7）YAP是巨噬细胞中Foxo1介导的STING功能免疫调节在脂毒性诱导的线粒体氧化应激中所必需的。

在证明了巨噬细胞YAP-NICD互作在调节HFD诱导的氧化应激中STING功能的关键作用之后，作者进一步在体外研究了YAP在免疫和代谢调节中的机制作用。

图 7：YAP是巨噬细胞Foxo1介导的STING功能免疫调节在脂毒性诱导的线粒体氧化应激中所必需的。从Foxo1M-KO小鼠中分离的骨髓源性巨噬细胞（BMMs），转染CRISPR/Cas9介导的YAP基因敲除（p-CRISPR-YAP KO）或对照载体，然后在与0.2 mM棕榈酸（PA）和0.4 mM油酸（OA）混合物孵育24小时后，与原代肝细胞共培养。 a. CRISPR/Cas9介导的YAP基因敲除增强了PA刺激的巨噬细胞中cGAS、p-STING、p-TBK1和p-P65的表达。 b. 在PA和OA刺激的Foxo1M-KO巨噬细胞中，IL-6、TNF-α、CCL2和IL-β的mRNA水平升高。 c. ELISA分析显示，在p-CRISPR-YAP-KO细胞中HMGB1的释放显著增加，而在对照细胞中没有增加（每组n=4个样本）。 d. 免疫荧光染色显示，p-CRISPR-YAP KO在Foxo1M-KO巨噬细胞中增加了与PA/OA共培养后肝细胞的ROS产生（每组n=4个样本）。定量ROS产生巨噬细胞（绿色）。 e. 在与p-CRISPR-YAP KO转染的Foxo1M-KO巨噬细胞共培养后，肝细胞中TFAM、COX-1和UCP3的表达降低。 f. 定量RT-PCR分析显示，p-CRISPR-YAP KO减少了与p-CRISPR-YAP KO或对照载体转染的巨噬细胞共培养后肝细胞中的mtDNA水平（每组n=4个样本）。 g. Oil Red O染色显示，在与p-CRISPR-YAP-KO或对照载体转染的巨噬细胞共培养后，肝细胞内细胞质脂质增加（每组n=4个样本）。

（8）Foxo1–YAP轴调控HFD诱导的NASH中STING介导的肝脏炎症和脂肪变性。

接下来，作者分析了Foxo1–YAP轴在调节NASH中脂质代谢和STING介导的炎症中的作用。

图 8：Foxo1–YAP轴调节HFD诱导的NASH中STING介导的肝脏炎症和脂肪变性。 a. 代表性的组织学染色（H&E和Oil Red O）显示，Foxo1M-KO小鼠表现出脂质积累减少，而Foxo1/YAPM-DKO小鼠在24周HFD喂养后表现出肝脏脂肪变性增加（每组n=6个样本）。 b. 基于组织学图像测量的NAS（NAFLD活动评分）在Foxo1/YAPM-DKO组显著增加（每组n=6个样本）。 c. Foxo1/YAPM-DKO小鼠的肝脏/体重比显著更高（每组n=6个样本）。 d. Foxo1/YAPM-DKO小鼠的TG和TC水平（mg/g）显著增加（每组n=6个样本）。 e. Foxo1/YAPM-DKO小鼠表现出显著增加的血清ALT和AST水平（IU/L）（每组n=6个样本）。 f. 代表性的免疫荧光和免疫组化图像（α-SMA和Masson）显示Foxo1/YAPM-DKO肝脏的肝纤维化显著增加（每组n=6个样本）。 g. 定量RT-PCR分析显示Foxo1/YAPM-DKO脂肪肝中cGAS、p-STING、p-TBK1和p-P65的表达上调（每组n=6个样本）。 h. Western blot分析揭示Foxo1/YAPM-DKO在脂肪肝中cGAS、p-STING、p-TBK1和p-P65的表达增加，且核PGC-1α、LIMD1和NICD的表达增加。 i. 免疫荧光染色显示，在缺血肝脏中CD11b阳性巨噬细胞的积累增加（每组n=6个样本）。 j. 在脂肪肝的Foxo1/YAPM-DKO肝脏中，TNF-α、IL-1β、IL-6和CXCL-10的mRNA水平增加，而IL-10水平降低（每组n=6个样本）。 HFD诱导的NASH小鼠Foxo1/YAPM-DKO加剧了STING介导的肝脏炎症、脂肪变性和纤维化。   

参考文献：

Xu D, Qu X, Yang T,Sheng M, Bian X, Zhan Y, Tian Y, Lin Y, Jin Y, Wang X, Ke M, Jiang L, Li C, XiaQ, Farmer DG, Ke B. The Foxo1-YAP-Notch1 axis reprograms STING-mediated innateimmunity in NASH progression. Exp Mol Med. 2024 Aug 9. pii:10.1038/s12276-024-01280-5. doi: 10.1038/s12276-024-01280-5. PubMed PMID:39122845.