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上海唯那生物：微生物基因组研究扫盲系列zhuanlan.zhihu.com上海唯那生物：微生物基因组研究扫盲系列|1zhuanlan.zhihu.com

A1：NCBI中大肠杆菌基因组序列的差异变化比较大，基于此有两种方法：

方案一：

1： 一株大肠杆菌进行denovo测序获取基因组序列，作为参考基因组序列；

2： 另一株大肠杆菌则以步骤1中得到的序列作为参考基因组序列，进行二代测序；

3：将步骤2中得到的数据mapping到1中的基因组序列，如果mapping比率大于98%，则说明二者属于同种菌；如果mapping比率小于90%，则说明二者属于不同菌种，只属于同属。

4：同时，根据二者序列间的比较可以进行SNP分析。

方案二：

1：两株大肠杆菌都进行denovo测序，测序结果分别进行组装，；

2：两者比较序列的一致性，如果一致性大于98%则说明二者属于同种菌；如果一致性小于90%，则说明二者属于不同菌种，只属于同属；

3：同时，在基因水平上，对两者进行同源基因的聚类分析，寻找差异基因；根据NCBI中的大肠杆菌的基因组序列，进行构建进化树分析。

Q1：如何打开fastq原始数据文件？

A1：可以使用UltralEdit或者Notpad进行打开。

软件获取方式：请使用百度网盘下载，材料仅限用于科学研究和学习，请勿商业化使用。

链接：https://pan.baidu.com/s/1KEgR_bQghy3xMGlOB332Cw

提取码：5e7d

Q2：细菌基因组评估及组装的时候如何选择K-mer值？

A2：评估基因组大小的时候k值是我们人为定的，一般都是17；基因组组装时候的k-mer值是由软件定的，一般软件自动计算k从21-129的所有结果，选出最好的结果来定k的值，结果好坏主要看N50的值。

Q3：一般评价细菌基因组组装效果的指标有那些？大概都在什么样的范围算是比较正常的？

A3：我们进行多个k-mer参数的拼接后，会综合考虑scaffold N50长度值、N%、scaffold数量、总碱基数等指标，一般要求N50较长，N%较低，scaffold数量相对较少，这样拼接比较集中，不至于太零散；依据这些技术指标进行综合评定，来选取最终的组装结果；因为不同菌的基因组有差异，分析要达到的精细程度也不同，所以会根据客户要求和基因组情况选取最佳结果，各个指标的范围也不同。

Q4：什么叫做ScaffoldN50？

A4：将所有scaffold序列按照长度从长到短排列，将序列长度按照该顺序依次相加，当相加的长度达到序列总长度的50%时，最后一条序列的长度叫做ScaffoldN50。

Q5：我们在获得了基因组序列以后怎么样能知道测序覆盖度的情况？

A5：获得基因组序列后，若要知道整个基因组的平均覆盖深度，可以这样计算：覆盖深度= 测序碱基总数/基因组长度；若是要知道具体每一个碱基位点的覆盖度，需要先做比对，用软件bowtie、SOAP或BWA等，然后编写程序或使用软件计算，如利用BEDTools可以计算per-base coverage（BEDTools软件网址：https://bedtools.readthedocs.io/en/latest/index.html）。

Q6：什么是基因组测序深度与覆盖率？

A6：测序深度：测序得到的碱基总量（bp）与基因组大小（Genome）的比值，它是评价测序量的指标之一。假设一个基因大小为2M，测序深度为10X，那么获得的总数据量为20M。

覆盖度：是指测序获得的序列占整个基因组的比例。

Q7：细菌基因组扫描图、完成图的区别？

A7：细菌基因组扫描图、完成图主要区别是组装完整性的区别，扫描图得到的都是scaffold级别的基因组序列（即一些片段化的序列，scaffold与scaffold之间是有gap的），完成图可以得到完整的基因组序列信息，没有gap。

Q8：为什么在扫描图里面rRNA预测不完整？

A8：由于rRNA存在高保守区和高可变区，且有高拷贝，情况较复杂，扫描图或精细图的组装级别达不到，无法完全预测出所有。

Q9：一般扫描图中contig的数目比scaffold多，scaffold是排除了一些contig重复片段之后组成的吗？

A9：contig的简单理解是从reads直接组装获得的较大片段的集群，每一段都是连续的，中间没有任何间隔区，一般而言，准确度还是比较高的；

scaffolds是基于构建文库时插入片段的大小，结合contig的序列信息，将多个contig按照一定的排序合并在一起，有些时候中间可能会有N，并且N的数量与真实情况可能会有一点差异。一条scaffold可以是一条contig，也可能是含有多条contig，所以，这不是排除重复的问题，而是将contig串起来变成更大的片段的展示形式，因此，contig的数目肯定不会少于scaffolds的数目的，要么相等，要么更多。在基因组分析中，一般会以scaffolds的数量和大小判定基因组组装的效果。

Q10：对于扫描图如何知道大概有多少序列没有测出来或者组装出来？

A10：可以利用参考序列来得知，参考序列的意义是搭建一个框架，虽然不同的个体，不同的组织基因组序列不同，但是框架是一样的，新一代测序得到的数据可以根据这个框架搭建起来。若分析的物种具有近缘参考序列，可以根据这个参考序列的大小来对我们的组装结果进行评估；若没有参考序列，则可以用K-mer的方法来预测基因组的大小，估计组装是否完全

微生物基因组公开课：

1.细菌基因组测序方式：重测序、扫描图、完成图、转录组如何选择

2.细菌基因组研究思路和案例分享

3.常见的比较基因组分析有哪些

4.什么是基因水平转移（HGT)?如何研究细菌的HGT?

5.PC电脑上如何绘制高水平的基因组圈图？

6.如何使用BRIG绘制比较基因组圈图？

7.如何通过BLAST软件进行比较基因组分析？

8.BRIG高级使用与常见问题？

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