从囊胚的内细胞团 (ICM)建立的胚胎干细胞（ESCs）具有分化多能性，称之为多功能干细胞（PSCs），它们可以通过体外自我更新分化为构成人体的多种细胞类型。人类胚胎干细胞的初期设计的目的是具有无限自我更新能力，然而，反复的细胞增殖会导致基因组变异和自分化的细胞群体。因此，ESCs最终培养成异质性的细胞群体。在开发细胞治疗产品时，体外培养的 PSCs 之间的异质性是一个主要障碍。因此有必要对PSCs细胞群体对进行单细胞转录组分析刻画其异质性特征。2021年发表在Int. J. Mol. Sci.期刊的综述文章Single-Cell Transcriptome Analysis as a Promising Tool to Study Pluripotent Stem Cell Reprogramming对scRNA-seq技术应用于多功能干细胞研究进展进行了总结，接下来，小编带你了解其中的奥秘和精彩。
前言
人体由近40万亿个细胞组成，这些细胞彼此协调执行各种生物学功能。要了解这些复杂的相互作用，需要描述出每个组织众细胞的转录表达动态，而且每个细胞都经历了数千次分化和分裂周期的基因组变异，细胞中的动态分子机制可以根据细胞环境而改变，因此构成组织的细胞群体具有复杂的异质性和互作关系。因此，可以通过研究单细胞水平的 mRNA 表达来探索细胞命运。
技术的快速发展可以从单细胞中扩增 mRNA 来研究转录表达水平，进而发展到可以在单细胞水平上研究由数百万个细胞组成的组织或细胞群。单细胞技术发展推动了人类细胞图谱项目，在单细胞水平上识别所有人类组织的基因转录和表达状态。单细胞转录组技术不仅可以用于细胞图谱构建，还扩展到各种疾病分析以及发育分化研究。同样，单细胞分析在干细胞研究中具有重要应用，单细胞转录组分析可以回答该领域的许多问题，如体外环境中干细胞的特征、分化为成熟体细胞过程中细胞命运的轨迹，以及基因表达如何诱导体细胞分化或体细胞重编程。
多能干细胞具有自我更新和分化成三个胚层的能力，多能干细胞系包括源自畸胎癌的胚胎癌细胞、源自生殖细胞的胚胎生殖细胞以及源自受精后囊胚阶段的内细胞团的胚胎干细胞 (ESC) 。通过引入四种转录因子建立的诱导多能干细胞 (iPSC) 和通过体细胞核转移建立的 SCNT 细胞也被认为是多能干细胞。即使在未分化环境中培养，这些细胞系包括不同细胞状态的自发分化细胞，当试图了解分化轨迹时，细胞状态的异质性也是一个关键变量。就PSCs 诱导疗法的发展而言，有致瘤潜能的细胞混合在一个群体中仍然是一个风险因素。因此，区分功能性群体和异质 PSCs 中具有致瘤潜力的群体非常重要，并且阐明多能性调控因子和分化潜能的独特表达状态，需要通过单细胞mRNA测序（scRNA-seq）了解不同细胞是如何构成PSC的。基于这些数据，我们可以模拟体外发育过程，为患者提供干细胞重编程的定制化服务。
scRNA-seq应用于未分化的PSCs研究
自 2012 年 Smart-Seq 出现以来，scRNA-seq技术在人类 ESCs 上开始应用。基于 scRNA-seq 分析，人类ESCs 被分为8个细胞群，并且可以分析共调控基因模块。此外，使用人类植入前胚胎和胚胎干细胞，绘制了第一个长链非编码 RNA 表达图谱 ，作为首次使用人类ESCs 进行的单细胞转录组分析，这是一项重大成就。由于使用少量细胞，其区分亚群的能力有限，因此，基于微孔和液滴的高通量scRNA-seq 的发展在 ESCs 研究中发挥了更为关键的作用。
通常，ESCs多能性状态分为naïve和primed两种状态。尽管人和小鼠 ESCs 均来自植入前囊胚的 ICM，但它们具有不同的转录组学、表观遗传学和形态学特征。小鼠 ESCs处于naïve状态，表达包括 OCT4、KLF4 和 DPPA3在内等基因调控网络，在雌性小鼠中ESCs有两条 X 染色体处于激活状态，整体呈现低DNA 甲基化水平。而人类 ESCs 在发育过程中处于primed状态，在植入后的外胚层中，primed hESCs 具有分化多能性，Messmer等人通过化学方法将primed hESCs 转化为naïve hESCs，并通过 scRNA-seq 分析多能状态特征并比较细胞亚群，研究人员发现多能性特异性标记基因 OCT4、SOX2 和 NANOG在两种状态细胞中表达水平类似，primed状态的细胞表达组织再生标记基因 HMX2 和神经发育标记基因 SOX11，显示出晚期发育阶段的特征，naïve状态的细胞表达与生殖细胞功能特征标志物HORMAD1 和 KHD3CL。此外，naïve hESCs 有一类亚群同时具有naïve状态和primed状态特征，并且具有多能性相关分子表达特征。
Nguyen等使用scRNA-seq揭示iPSCs在转录水平异质性。使用代表多能性的 165 个基因，划分四个独立的 iPSCs 亚群，确定了不同亚群之间分化轨迹。尽管该研究仅限于一个 iPSCs 系，但它在单细胞水平上为未分化的 iPSCs 提供了精细转录图谱，提高了对 iPSCs 复杂性和异质性的理解。
scRNA-seq用于体细胞重编程干细胞研究
体细胞可以通过转入四种转录因子（OCT4、SOX2、KLF4 和 CMYC）的诱导重编程为 PSCs 。为了揭示这种复杂重编程的分子机制，通过 NGS 方法分析了重编程的转录动态变化，bulk NGS 分析表明重编程过程早期细胞显示出增殖、代谢和细胞骨架组织的变化，而重编程过程后期的细胞显示出整体的多能基因网络激活。即使重编程诱导的转录因子成功表达，重编程效率也极低，成功重编程的细胞与未成功重编程的细胞混合在一起，而且并非所有重编程细胞都同时或以相同顺序经历重编程过程。Lin等人使用 scRNA-seq技术在重编程期间将细胞分为重编程和非重编程潜力类别，得到了两者之间分支点。
重新编程是一个随机过程，重编程诱导群体中的极少数细胞实际上被重编程，因此，很难检测完全重编程的 iPSC 的变化。因此，单细胞转录组的分析对于准确理解体细胞的整个重编程过程、识别细胞命运决定因素以及制定克服重编程障碍的策略至关重要。scRNA-seq 在重编程研究中的一个优势是推断重编程轨迹，通过在整个重编程过程中的多个时间点收集数据，对小鼠 iPSCs 重编程过程进行 scRNA-seq分析发现细胞从间充质转化为上皮细胞，产生了与多能性、胚胎外和神经细胞相关的群体。进一步通过 scRNA-seq 分析发现体细胞重编程时会出现多次重编程，Obox6是出现在第二次重编程后的转录因子，旁分泌因子 GDF9在重编程过程中可以介导细胞间相互作用，提高重编程效率。小鼠胚胎成纤维细胞 (MEF) 重编程为 iPSC 时，研究人员在时间进程分析中确定 14 个细胞群的多能性，确定了重编程细胞的细胞命运转化的路径、速度和效率。发现所有的间充质相关基因没有在同一阶段下调，间充质基因的下调和 CDH1 的上调被发现是独立进行的，而同一细胞内的共表达 NANOG、SALL4、TDGF1 和 EPCAM 准确预测 iPSC 状态的过渡。
Xing等人用scRNA-seq和scATAC-seq进一步阐明人类体细胞重编程进程。两种单细胞测试技术的组合提供了更全面的单个细胞及其身份的分子图谱，研究结果表明从 FOSL1 调控网络到 TED4 调控网络的转变导致细胞进入多能状态。scRNA-seq 和 scATAC-seq 在研究这些重编程的异质组中的组合应用继续推进我们对重编程效率相关障碍的理解 。
小结
长期以来，生物学家一直致力于在单细胞水平上分析基因表达。过去主要通过 RNA 原位杂交、免疫染色或特定蛋白质的 FACS 来实现。然而，这些方法中在每个实验中只能鉴定几个基因，并且由于细胞组成的异质性，对整个细胞群体的bulk mRNA 测序有局限性，为了克服这些限制，需要跟踪异质性的细胞亚群并了解通路动力学特征，单细胞转录组技术自 2009 年推出以来就广泛应用。特别是在干细胞研究中，可以广泛应用于鉴定细胞分化潜能、细胞命运决定因素和异质性，最近，单细胞转录组用于体外干细胞诱导分化分析从而推断出干细胞命运决定轨迹，鉴定出功能性细胞亚群，加强发育研究，并确定潜在疾病原因，有助于设计出更安全、更有效的干细胞治疗产品。
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参考文献
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