基因表达失调几乎与所有人类疾病相关，而表观遗传修饰可以介导这一过程。表观遗传编辑旨在通过重写表观遗传标记来重新编程基因表达，而无需编辑基因组。表观遗传编辑的概念诞生于十多年前，最初在疗效和特异性方面面临着诸多挑战。此外，如何针对特定基因诱导持续表达调控的明确指导原则仍然十分缺乏。然而，在多种疾病的动物模型中，表观遗传编辑已取得一定成功，并且首批临床试验也已启动。对表观遗传重编程机制的深入理解正在克服最初阻碍表观遗传编辑广泛应用的障碍。未来在靶向特异性、重编程维持和递送方法方面的进展将使表观遗传编辑成为一种强有力的新型治疗方法。
短短十年间，表观遗传编辑（即靶向基因的表观遗传修饰重写）领域已从概念验证发展到临床研究。这一进展得益于大规模的多组学研究，这些研究揭示了许多疾病与基因表达的整体变化以及DNA上的表观遗传修饰（例如胞嘧啶甲基化）及其相关的组蛋白（图1a）密切相关。这些发现推动了表观遗传修饰酶（如写入酶、擦除酶、读取酶或重塑酶）小分子抑制剂的商业化开发（图1b）。目前，已有十种表观遗传药物获得FDA批准（见表1），其中九种用于肿瘤治疗，最近一种用于治疗杜氏肌营养不良症，还有更多药物正在研发中。然而，尽管这些药物主要对某些血液系统恶性肿瘤有效，但它们的作用范围广且短暂，并伴有毒性，限制了其广泛的临床应用。对特定基因组位点的表观遗传修饰进行控制编辑，提供了一种替代方法，可以稳定地重编程靶基因表达，而不会影响整个表观基因组，也不会改变DNA序列。
尽管通过在真核细胞中招募催化表观遗传效应因子来改变特定内源基因组位点的表观遗传修饰这一概念（图1c，左）早在2003年就被报道用于组蛋白修饰和DNA甲基化，但在接下来的十年里，它却相对被忽视。十年后，当这种方法被命名为表观遗传编辑时，只有少数实验室报道了在哺乳动物细胞中编辑内源位点的特定表观遗传修饰以调节靶基因表达，而表观遗传编辑在治疗乃至治愈疾病方面的巨大潜力却鲜为人知。CRISPR技术的出现，作为一种廉价、灵活且特异性强的基因靶向工具，极大地推动了表观遗传编辑研究的快速增长。事实上，过去十年见证了学术界和商业界对表观遗传编辑的大量投资，将其视为一种研究工具和治疗策略。最近在小鼠和猴子模型中通过表观遗传编辑实现持久有效的治疗性基因沉默的体内实验（与CRISPR基因敲除相当）引发了人们对这项技术的更大兴趣。
表观遗传编辑公司如今已成为生物技术和制药行业的重要参与者（表2），致力于利用表观遗传编辑技术开发针对多种疾病（例如癌症、神经退行性疾病和遗传性疾病）的创新疗法。事实上，首个表观遗传编辑工具OTX‑2002（Omega Therapeutics 公司）的临床试验已于2022年启动。OTX‑2002是一种由脂质纳米颗粒（LNPs）递送的mRNA编码的表观遗传修饰剂，旨在降低肝细胞癌和其他MYC相关实体瘤中MYC癌基因的表达。最近，Tune Therapeutics在新西兰和香港启动了临床试验，测试一种表观遗传沉默剂治疗慢性乙型肝炎和丁型肝炎；Epicrispr在美国和新西兰启动了一项试验，用于治疗面肩肱型肌营养不良症(FSHD)（表2）。
尽管表观遗传编辑作为一种临床策略前景广阔，但谨慎行事是必要的。目前，表观遗传编辑作为一种治疗手段的发展速度超过了我们对表观遗传调控的认知，这可能导致在早期临床试验中测试的药物并非最佳选择。事实上，实现简便、有效、持久且可逆的表观遗传编辑的规则和工具在很大程度上仍不为人知，而且很可能取决于具体情况。此外，表观遗传编辑的安全临床转化将面临与DNA编辑技术类似的挑战，尤其是在递送方面。
本综述旨在对表观遗传编辑的潜力和不足进行平衡的探讨。首先，本文回顾了具有里程碑意义的研究，这些研究证明了表观遗传编辑的潜力，并克服了最初认为的局限性。鉴于表观遗传编辑的快速临床转化，解决这些先前的障碍提供了值得认真考虑的深刻见解。接下来，本文回顾了体内表观遗传编辑研究，这些研究表明，将表观遗传修饰酶和/或擦除酶靶向目标基因有望成为治疗多种疾病的临床方法。本文特别关注递送问题，这是表观遗传编辑临床开发的主要挑战之一。学术界和商业界对DNA编辑方法的大量投资有望解决至少部分技术递送难题。如果能够获得足够的时间和资源来从临床结果中吸取经验，这些编辑研究将为表观遗传编辑成为临床领域的新兴力量铺平道路。
表观遗传编辑工具
人体内绝大多数细胞的遗传信息总体上保持稳定，但不同类型的细胞却具有不同的细胞程序、形态和功能。这种显著的能力是通过表观遗传机制实现的，其中包括对DNA分子和组蛋白的调控性化学修饰。这些机制共同构成表观基因组，并以有丝分裂稳定的方式调节核小体定位、染色质可及性和基因表达。
胞嘧啶DNA甲基化（5mC）是基因组中胞嘧啶结构单元的一种共价化学修饰，其位置会影响基因表达，从而调控分化程序。5mC的失调可能导致功能障碍，因此已被广泛研究作为疾病诊断的生物标志物。另一方面，组蛋白的翻译后修饰也会影响基因表达。例如，组蛋白乙酰化可以募集参与转录起始和染色质重塑的含溴结构域蛋白。尽管技术难度更高，但差异性组蛋白修饰已被研究作为疾病的生物标志物。为了验证失调基因作为治疗靶点的有效性，人们开展了包括基因靶向策略在内的各种研究，以探究基因在其相关背景下的功能。由于表观遗传失调经常与疾病相关，因此恢复或修改基因表达谱的表观遗传干预措施在临床应用中具有重要前景。
表观遗传编辑可以通过写入活性修饰来驱动基因表达，这些修饰可以募集转录机制或增加染色质可及性（图1d），或者通过消除抑制性修饰来驱动基因表达。表观遗传编辑通过写入抑制性修饰来沉默基因表达，其机制包括直接阻断转录因子对其靶DNA序列的识别，或促进染色质压缩以限制转录因子的募集（图1e）。此外，表观遗传编辑还可能驱动表观基因组的二次改变，这些改变协同作用，最终实现基因的强效激活或沉默。例如，靶向募集活性组蛋白乙酰化擦除因子可以募集内源性抑制性组蛋白甲基化写入因子。目前已有大量表观遗传写入因子和擦除因子被研究，极大地增进了我们对基因调控表观遗传机制的理解。
表观遗传编辑器
表观遗传编辑可以定义为针对特定基因位点的表观遗传修饰的覆盖，从而改变基因组位点的功能。为了实现这一目标，理想的表观遗传编辑器应包含一个小型、无免疫原性、易于编程的基因特异性DNA结合域（DNA binding domain，DBD），该DBD与表观遗传效应域或多个表观遗传效应域融合，从而能够仅在靶位点直接写入或擦除表观遗传修饰。因此，表观遗传编辑能够将表观遗传标记重写为显性或隐性的修饰，永久性地重编程染色质功能（例如基因表达），同时保留可逆性。本综述重点关注直接的酶促作用机制（指的是利用催化效应结构域（表观遗传写入器或擦除器）直接写入或重写表观遗传修饰（图1c，左图），这些结构域与靶向特定DNA序列的可编程DNA结合结构域融合），而非同样前景广阔的基因靶向表达调控方法，后者并不直接重写表观遗传修饰。人工转录因子（Artificial transcription factors，ATFs）是一类重要的间接表观遗传编辑工具，本文也描述了从其发展中获得的一些见解，因为这有助于优化直接表观遗传编辑工具。结合高效且细胞特异性的递送方法，表观遗传编辑有望成为一种多功能工具，用于纠正多种病理生理现象。
直接表观遗传编辑
本综述使用“直接表观遗传编辑 (direct epigenetic editing)”一词，指的是：使用催化效应结构域（表观遗传写入器或擦除器）直接写入或重写表观遗传修饰（图 1c，左图）并与可编程DNA结合结构域（DBD，见方框 2）融合，该结构域靶向特定的DNA序列。这一严格的定义使本文重点关注报告基因组位点直接表观遗传覆盖效应和维持的研究。因此，对体内研究的全面总结（表 3）排除了不靶向特定位点的编辑方法，例如那些使用内源性转录因子DBD或表观遗传读取蛋白在基因组的多个位置募集催化结构域的方法。此外，该定义排除了间接表观遗传效应因子（图1c，右图），包括人工转录因子（ATFs），它们可以通过募集表观遗传酶间接改变基因位点的表观遗传特征（见方框3）。尽管本文重点关注直接表观遗传编辑，但也重点介绍了一些使用间接表观遗传效应因子的开创性研究，这些研究为直接表观遗传编辑提供了重要的见解，并体现了临床领域的重要进展。
可编程DNA结合域。最初人们探索了多种类型的可编程DBD，包括合成聚酰胺和三链形成寡核苷酸，但这些方法被证明难以广泛应用。在CRISPR技术问世之前，工程化锌指蛋白（zinc finger proteins，ZFPs）和植物病原体衍生的转录激活因子样效应蛋白（transcription activator-like effectors，TALEs）主导了可编程DBD领域（方框2）。基于真核生物中最丰富的转录因子设计的ZFP体积较小（约含30个氨基酸，每个结合3‑4个碱基对的锌指），尤其与CRISPR‑Cas9（约含1000‑1400个氨基酸，靶向20个核苷酸）相比，其体积更小，通常由3‑6个模块化的工程化锌指阵列组成。TALEs也相对较小（每个TAL重复序列约含33‑35个氨基酸），一个重复序列可与靶DNA中的一个碱基对结合。ZFPs和TALEs都需要对每个重复序列进行蛋白质工程改造才能实现基因靶向。与ZFPs和TALEs相比，CRISPR‑Cas9平台的相对简便性和低成本彻底革新了靶向基因组编辑（方框2）。CRISPR‑Cas9问世后不久，其核酸酶失活版本（dCas9）被报道，使得表观遗传编辑得以广泛应用于众多科学领域的研究人员。
可编程DNA结合域 (ZFPS、TALES、CRISPR)
早期的可编程DNA结合域(锌指蛋白(ZFPS)和转录激活因子类似效应物(TALEs)) 最初被用于通过将这些蛋白与核酸酶融合来诱导双链断裂。尽管目前这些技术已被更具灵活性的CRISPR平台所取代，但 ZFPs和TALEs仍被广泛应用于基础及临床研究中，并且正不断得到进一步发展。这归因于其较小的尺寸、较低的免疫原性以及DNA结合方式 (保持双链结构完整。ZF核酸酶与TALE核酸酶融合体 (ZFNs/TALENs) 被用于针对特定位点的基因组编辑的基础性研究，并为靶向其他效应物域奠定了基础。CRISPR的引入极大地促进了基因组编辑，因为它具有固有的核酸酶活性和简单的低成本重编程。CRISPR-Cas9 核酸酶使用RNA引导的DNA靶向，这依赖于核苷酸同源碱基配对，并避免了为每个靶DNA设计新的ZFP或TALE蛋白的需要。CRISPR基因组编辑已经发现28个临床成功，例如，在治疗白血病和失明重要的是，第一个CRISPR药物 (Casgevy)最近在英国和美国获得批准，用于治疗镰状细胞病和地中海贫血。 然而，基因组编辑疗法的进一步发展必须受到严密监控，以避免过早出现可能阻碍该领域发展的失败情况，正如21世纪初的基因疗法所经历的那样。例如，毒性已导致部分参与试验的患者死亡，而对免疫反应和DNA损伤的长期影响尚有待评估。基因组编辑最具不可预测性的毒性在于因双链断裂而导致大片段染色体的丢失，但也不能排除对宿主DNA序列的其他意外改变。为了克服这些局限性，CRISPR-Cas9核酸酶已被进行突变，以阻止双链断裂的引入，而仅对DNA的一侧进行切割。将Cas9切割酶与碱基编辑和prime编辑效应物融合，为无双链断裂的基因组编辑提供了强有力的替代方案。尽管取得了这一进展，但遗传毒性问题仍无法排除，因为DNA切割仍会激活DNA修复途径。除了对患者造成的毒性影响外，还存在与靶标和非靶标基因组工程的可遗传性相关的风险。因此，用于表观遗传学编辑的经核酶灭活后的CRISPR-dCas9系统，或许能为临床应用领域提供一种更为安全的替代方案。
能够调控基因表达的转录效应结构域和其他间接表观遗传编辑因子。人工转录因子（框3）由DBD与全长蛋白质（或结构域）融合而成，它们在不直接编辑表观遗传修饰的情况下调节基因表达（图1c，右）。研究最为广泛的是源自病毒或人类转录因子的转录效应因子。许多转录激活因子已被验证，包括病毒VP16四聚体VP64、病毒RTA48以及来自人类转录因子p65或NCOA3、FOXO3和ZNF473的结构域。转录抑制因子包括来自ZNF10、ZIM3或ZNF705等的KRAB结构域。这些ATFs的募集可通过内源性表观遗传机制的二次募集间接导致表观遗传修饰，但这些效应难以预测，且大多数ATFs的作用通常是短暂的。例如，在小鼠模型中，沉默与Angelman综合征相关的反义转录本需要重复递送ZF-KRAB才能实现长期抑制。类似地，ATFs短暂表达后对靶基因激活的影响会随时间推移而减弱。因此，持久的基因调控需要ATFs的长期表达，这通常通过使用整合到宿主基因组中的慢病毒或腺相关病毒（AAVs）来实现，AAVs以游离体形式维持，仅在细胞分裂时才会被稀释。在这方面，单次递送AAVs表达ZF-KRAB足以持久地挽救Angelman综合征小鼠模型的行为表型。然而，ATFs的持续表达掩盖了稳定靶基因调控的间接机制，包括染色质的变化。
人工转录因子(间接表观遗传编辑)
为了利用基因靶向技术，同时不对基因序列进行任何改动，已将转录激活剂或阻遏剂与可编程的DNA结合域融合在一起。这种人工转录因子 (ATFs) 具有“唤醒沉睡基因”以及“抑制尖叫基因”的潜力。这与编辑基因序列的方式截然不同，后者会永久性地改变基因组，通常会导致基因表达完全消失，或者与CDNA基因疗法相反，旨在(过度)表达外源基因。尽管目前仍使用并优化RNA靶向方法，如小干扰RNA(SiRNA)和反义寡核苷酸(ASOs)等，但ATFs相较于这些方法具有优势，包括能够以相同技术实现上调或下调作用，能够临时性地从内源位点调控单个转录本异构体，能够进行部分敲低或更生理性的上调(而非过度表达)以调节干预效果。
二十年前，SangamoBiosciences启动了首个ATF临床试验转录激活剂ZF-p65被靶向VEGFA并施用于糖尿病患者，以诱导血管生成并减少神经病变。到2008年，该构造已在第II期临床试验中得到测试(糖尿病神经病变、干细胞动员、肌萎缩侧索硬化症)。尽管VEGFA-ZF-D65在患者中耐受良好，但与接受安慰剂治疗的糖尿病患者相比，其治疗效益有限，而安慰剂患者的表现优于接受常规医疗的患者。进一步的临床研究工作随即被叫停，而研究重点转向了锌指核酸酶(ZFNs)。
由于CRISPR平台的多功能性，人们对将CRISPR用于基因表达调控产生了广泛的兴趣。通过使用组合式单向导RNAs (sgRNAs)和效应结构域，以及新型效应蛋白募集方式，CRISPR的效率得到了进一步提高。dCas9与多个效应结构域融合可以增强靶基因的激活，例如dCas9-VPR（VP64、p65 和 RTA）、协同激活介质 (SAM；MCP-p65-HSF1) 或 NFZ（NCOA3、FOXO3、ZNF473）。其他平台包括 dCas9-亲和标签融合蛋白（可募集抗体-效应蛋白融合蛋白，如SunTag、SSSavi）和 sgRNA-MS2 茎环融合蛋白（可募集茎环结合蛋白-效应蛋白融合蛋白）。高通量筛选最近发现了一些结构更紧凑、效力更强的候选转录效应结构域（40-85个氨基酸），这些结构域在多个基因位点高效发挥作用，并有望改善ATFs在转化应用中的递送效率。ATFs在开拓体内治疗相关性以及展示等位基因特异性、多重和双向基因调控方面发挥了重要作用。
激活ATFs在体内的有效性已在针对多种病理状况的研究中得到证实。例如，dCas9-SAM诱导的Oct4激活改善了衰老的特征表现，而ZF-VP64激活Psd95足以在衰老及阿尔茨海默病小鼠模型中挽救记忆功能。激活ATFs也可能被证明在治疗神经发育性疾病(如德拉韦特综合征)方面具有疗效。针对此类疾病，基于ZF-VP64的AAV临床试验已启动，其依据是小鼠和非人灵长类动物研究中取得的积极成果。利用ZF-KRAB或dCas9-KRAB ATFs进行靶向基因抑制显示出在代谢学、神经退行性疾病和神经发育障碍等领域中的翻译潜力，同时还有助于提升嵌合抗原受体(CAR)-T细胞的抗肿瘤活性。
其他能够调节基因表达的间接表观遗传编辑因子包括染色质读取因子，例如HP1和MeCP2，以及染色质重塑因子，例如BAF（图1b）。间接表观遗传编辑也可通过将DBD与未修饰的组蛋白H3尾部（H3K4me0）的一部分融合来实现（称为用于甲基转移酶自身抑制释放的偶联组蛋白尾部(CHARM)），该融合物可募集内源性DNA甲基转移酶3A (DNMT3A)，从而在分裂细胞中以KRAB介导的沉默增强表观遗传记忆。尽管在体内非分裂脑细胞中，维持DNA甲基化诱导的沉默并不需要KRAB，但这种KRAB‑DNMT3A3L组合通常用于后续详述的“即击即走（hit-and-run）”治疗。值得注意的是，使用KRAB和MeCP2的间接表观遗传编辑表明，无需DNA甲基化即可实现沉默的维持。事实上，仅将KRAB靶向整合的报告基因即可通过募集内源效应因子（KAP1和SETDB1，后者负责H3K9me3的写入）促进异染色质形成，从而导致稳定的基因沉默。延长KRAB募集时间或增加募集到靶位点的KRAB效应因子数量，均可增大H3K9me3异染色质区域的大小，最终导致更多的DNA甲基化（由于H3K9me3与DNA甲基化之间的内源性反馈）和增强表观遗传记忆。类似地，激活结构域与SS18（BAF的一部分）的组合也显示出间接诱导长期表观遗传改变的潜力。
直接表观遗传编辑因子。目前已发现许多能够写入或擦除表观遗传修饰的酶。对于大多数酶而言，其确切的（依赖于特定环境的）功能尚不清楚，而将其靶向基因组位点有助于揭示其作用机制。目前，已验证的直接催化表观遗传效应因子有多种，包括DNMT3A和DNMT3B、四甲基胞嘧啶双加氧酶（TETs）、组蛋白乙酰转移酶p300、组蛋白赖氨酸N‑甲基转移酶G9A、组蛋白去乙酰化酶3（HDAC3）和赖氨酸特异性组蛋白去甲基化酶1（LSD1）。由于表观遗传编辑酶能够在不改变DNA序列的情况下对基因表达谱进行长期调控，因此这些工具可能比不可逆的基因组编辑策略更加安全。
迄今为止，间接和直接催化表观遗传编辑剂的组合已成为有效且持续调控基因表达的最直接方法。最近的体内研究也证实了这一点，该研究将DNA甲基化（由DNMT3A介导）与KRAB对组蛋白修饰的间接作用相结合，从而导致长期沉默，尽管在某些情况下，DNA甲基化本身可能就足够了（另见方框4）。类似地，尽管仅通过靶向TET即可实现人工沉默基因的稳定重新表达，但持续激活天然沉默的基因可能也需要效应因子的组合。最近，高通量方法在酵母和人类细胞中测试了数千种组合构建体，发现了用于表观遗传沉默和激活记忆的新型组合。接下来将全面概述直接表观遗传编辑的发展历程，从具有洞察力的染色质生物学研究工具到一类具有广泛临床应用前景的新型灵活疗法。
高效、安全的直接表观遗传编辑的考量
当“表观遗传编辑”这一术语首次提出时，表观遗传学作为一门独立学科仍在发展之中，当时人们普遍认为表观遗传编辑的临床应用并不现实。最初的担忧主要集中在以下几个方面：首先，直接表观遗传编辑能否充分有效地写入或擦除表观遗传标记，从而调控内源基因表达；其次，临床应用所需的位点特异性；第三，表观遗传沉默基因能否被表观遗传编辑工具触及，因为这些基因紧密地排列在“封闭”的异染色质中；第四，诱导的表观遗传重编程的稳定性（图2）。这些潜在的缺陷限制了表观遗传编辑的早期应用，只有少数先驱实验室开展了相关研究。下文将回顾一些针对直接表观遗传编辑局限性的关键研究，并以间接表观遗传编辑为例，重点介绍一些重要的进展。
充分性和有效性
数十年的研究已证实，表观基因组的变化与基因表达的变化密切相关。为了验证因果关系，通过直接表观遗传编辑强制写入或擦除表观遗传标记是一种强有力的手段。在大多数情况下，靶向编辑染色质修饰确实足以改变基因表达。然而，目前尚无法预测在特定细胞类型中，对靶位点上的单个表观遗传修饰进行表观遗传编辑是否足以调控靶基因的表达（图2a）。这种困惑源于我们对转录和染色质之间机制联系的了解有限，以及人类基因调控⽹络的复杂性。在人类细胞中，存在约1600个转录因子和约900个染色质调控因子，转录和染色质调控之间存在广泛的相互作用。此外，不同细胞类型表达不同的转录因子和染色质调节因子亚群，从而影响表观遗传编辑的可能结果。
因果关系。理解表观遗传机制的一个重要考量是，特定的表观遗传修饰是基因表达的原因还是结果。例如，RNA聚合酶II的降解既会抑制转录，也会消耗活性组蛋白修饰；而Yamanaka转录因子过表达诱导的细胞分化会在基因表达改变之前引起表观遗传改变。H3K27乙酰化（H3K27ac）的研究凸显了每种表观遗传修饰功能尚不明确，H3K27乙酰化通常与活跃的基因表达相关。尽管研究发现，在多个赖氨酸残基（包括H3K27）上进行乙酰化的表观遗传编辑足以激活基因表达，但全基因组整合H3K27ac缺陷突变体破坏了Polycomb诱导的基因抑制（由H3K27me3介导），但对基础转录没有影响。另一种激活标记（H3K4me3）的作用可能是在转录延伸过程中释放停滞的RNA聚合酶II，而不是启动基因表达，这解释了为什么K4me3的写入并不总是足以诱导基因表达。这些研究以及其他研究表明，将单个表观遗传修饰与基因表达联系起来的机制仍在被解析；直接的表观遗传编辑有助于揭开这些机制的奥秘。
表观遗传修饰因子有效性的首个证据来源于对合成报告基因构建体的靶向研究。尽管此类构建体具有指导意义，但由于可能与转基因沉默存在协同作用，它们可能比内源基因位点更容易被沉默。2003年，靶向VEGFA启动子的ZF‑G9a和ZF‑Suv39H1率先实现了表观遗传编辑以沉默内源基因，从而富集了抑制性组蛋白修饰H3K9me3。直到十年后，ZF-G9a调控Her2/Neu18、TALE-LSD1调控增强子以及光激活TALEs调控Neurog2和Grm2的针对性研究才重现了通过表观遗传编辑抑制哺乳动物内源基因的现象。通过表观遗传编辑激活内源基因是通过写入活性修饰实现的，例如p300或CBP100介导的组蛋白乙酰化，或PRDM9介导的H3K4位点组蛋白甲基化。
除了组蛋白之外，DNA修饰的表观遗传编辑也被证明足以抑制或激活内源基因表达。利用ZF‑DNMT3A和与DNMT3L联合使用（ZF‑DNMT3A3L）首次证实了通过DNA甲基化修饰进行表观遗传编辑并抑制内源基因表达。靶向DNA去甲基化和相关的基因激活是通过募集TET1或TET1/2/3实现的。综上所述，这些早期研究表明，在内源基因处写入或擦除DNA甲基化确实可以指导基因表达的改变。这些早期的DNA甲基化编辑研究很快得到了大量的后续研究。总之，对内源基因的研究证实，DNA和组蛋白修饰的表观遗传编辑可以因果性地调控基因表达。
环境依赖性。尽管在许多情况下表观遗传编辑足以发挥作用，但研究发现，其有效性取决于靶位点、表观遗传效应因子和细胞类型。例如，表观遗传编辑以组蛋白H3K27甲基化的方式抑制基因表达，且这种抑制作用具有位点特异性；而表观遗传编辑组蛋白乙酰化或H3K4me3虽然编辑成功，但并非所有基因都能被激活。一项关于环境依赖性的系统研究发现，当H3K36me3的表观遗传编辑靶向含有CTCF的位点时，其有效性较高，但会被附近的YY1转录因子基序所抑制。鉴于此复杂性，需要采用系统方法来定义编辑器、靶位点和染色质环境的“相互作用规则”。预测表观遗传编辑结果所需的参数包括：效应域在写入或擦除靶修饰方面的效率；基因组位点的可及性，包括局部异染色质的程度；以及内源转录因子和染色质调节因子招募到靶位点的强度，这既包括修饰读取器，也包括DNA序列本身。
早期对表观遗传编辑“相互作用规则”的研究利用了某些锌指蛋白（ZFPs）的广泛结合特性，通过对全基因组DNA甲基化进行表观遗传编辑来探究基因抑制机制。正如预期的那样，DNA甲基化水平的升高抑制了许多基因位点的基因表达。然而，DNA甲基化编辑和基因抑制的效率因位点而异。低表达基因比高活性基因更容易发生DNA甲基化。此外，活性转录因子结合位点的甲基化水平升高会抑制基因表达，而抑制性转录因子结合位点的甲基化则会导致基因上调。DNA甲基化编辑的其他特性也有助于提高其效率，例如CpG的密度、核小体定位和替代转录起始位点（TSSs）的使用。
最后，为了确保基因表达的变化是靶向表观遗传编辑的直接原因，关键的对照实验至关重要。对照实验的选择较为复杂，可以包括：第一，单独的DBD；第二，DBD与催化失活的效应结构域融合；第三，单独的效应结构域；以及第四，非靶向或安全位点结合的DBD与效应结构域融合。第一和第二个对照实验可以确定DBD（融合蛋白）本身是否通过空间位阻干扰转录因子结合位点、组蛋白和DNA修饰酶或调控染色质可及性的核小体来调控基因表达。第二个对照实验对于排除其他内源性效应因子的非特异性募集所产生的任何间接影响也很重要。第三和第四个对照实验可以确定效应结构域是否募集到非靶向的内源性位点，从而间接调控靶基因位点。具有广泛作用的效应结构域的关键例子包括p300，它通过其非催化结构域募集转录因子；以及催化失活的DNMT3A，它通过与其伴侣DNMT3L的二聚化募集内源性DNMT3A。对LSD1的研究也强调了效应结构域的复杂性以及多重调控的必要性：尽管靶向募集这种组蛋白去甲基化酶可以消除H3K4甲基化并抑制活性增强子，但LSD1的催化失活对全基因组基因表达的影响有限。然而，全长LSD1的缺失可以解除全基因组增强子的抑制，这表明LSD1可以通过募集其他染色质调节因子来独立于其催化去甲基化酶功能发挥抑制作用。因此，精心选择和设计控制效应因子对于确定表观遗传编辑对基因表达的直接影响至关重要。
选择最佳靶向位置。尽管表观遗传编辑足以调控基因表达已是公认的事实，但仍需开展更多研究来确定每个效应结构域或组合的最佳靶向位置。为了确定启动子周围的最佳靶向窗口，一些开创性研究利用ATF dCas9–KRAB（CRISPR interference，CRISPRi）进行了混合生长筛选，并使用针对多个启动子周围数千个位点的向导RNA（gRNA）覆盖文库。这些研究表明，当靶向转录起始位点（TSS）下游约100 bp范围内时，dCas9–KRAB最为有效。相比之下，使用KRAB–dCas9–DNMT3A3L融合蛋白（CRISPRoff，包含DNA甲基化的直接写入器）进行的类似混合单向导RNA (sgRNA) 高通量筛选表明，当招募到TSS上游或下游约500 bp处时，它可以有效地沉默，因此与单独使用KRAB相比，它在启动子周围显示出更广泛的有效靶向窗口。
尽管目前讨论的大多数研究都是通过靶向基因启动子来调控基因表达，但有效的表观遗传编辑也可以发生在其他基因调控元件上，包括绝缘子和增强子。作为概念验证，各种利用dCas9–KRAB的间接靶向的高通量方法已用于识别增强子并将其与靶基因连接起来。然而，靶向这些基因调控元件对基因表达的影响通常取决于基因位点的特定结构和调控逻辑。事实上，最近一项使用双向ATFs（CRISPR activation and inhibition（CRISPRai））的研究表明，靶向“守门员”或显性增强子时，对基因表达有显著影响；而当基因受多个冗余增强子调控时，影响则较弱。尽管未来的研究将确定最佳靶点和效应域，但毫无疑问，表观遗传编辑在许多情况下对基因表达具有指导意义。
位点特异性
位点特异性的表观遗传编辑（图 2b）依赖于DNA结合域 (DBD) 和表观遗传效应域的特征。尽管ZFP和TALE DBD的计算机设计具有挑战性，但这些工具已在许多研究中实现了靶向特异性，包括体内研究。ZFP和TALE的靶向特异性因其在基因编辑工具临床应用中的潜力而得到强调。ZFP的设计已通过基于490亿个蛋白质-DNA相互作用训练的创新深度学习模型得到进一步优化。另一方面，CRISPR使用简单的sgRNA设计来促进基因特异性募集。尽管CRISPR设计简便，但由于sgRNA-DNA错配会导致一些脱靶结合，因此靶向特异性并不能得到保证。为了提高靶向特异性，CRISPR工程技术的进步包括利用 CRISPR 变体、对 sgRNA 进行化学修饰、对 CRISPR 平台进行诱变以及使用脱靶预测算法。然而，这些方法主要针对 Cas9 核酸酶，而非用于表观遗传编辑的dCas9。最终，基于更小的尺寸、DNA结合模式（不会破坏DNA双螺旋结构）以及更佳的免疫原性，ZFP或TALE可能比CRISPR 更具临床应用价值，而首个临床表观遗传编辑试验实际上正是利用了ZFP平台。
许多研究已证实表观遗传编辑具有特异性，例如在原代人造⾎⼲细胞和祖细胞（HSPCs）中利用dCas介导的DNA甲基化编辑，以及在肝脏中将锌指蛋白（ZF）与DNMT3A和KRAB融合。然而，表观遗传效应分子的选择也会影响特异性，某些效应分子会导致全基因组范围内的脱靶修饰。脱靶表观遗传编辑会抑制细胞生长并促进细胞死亡，从而阻碍稳定表达表观遗传编辑分子的细胞系的构建，例如TET1、p300和DNMT3A。事实上，DNMT3A的分离催化结构域的表达对细胞具有毒性，这一点已得到充分证实。仅融合催化核心或对效应结构域进行合理改造可能比全长内源性效应蛋白更能提高疗效，但并非总能有效提高特异性。远端基因组相互作用也可能导致脱靶表观遗传编辑，尽管有时这可能是一种受调控的、有益的结果。例如，针对年龄相关基因PDE4C或FHL2的靶向DNA甲基化，导致其他年龄相关CpG位点的甲基化，这可能增强了初始编辑的功能。实现等位基因特异性表观遗传编辑，是展现其特异性潜力的有趣例证。这些成就与蛋白质工程领域的创新相结合，实现了适用于临床应用的靶向特异性，这一点尤为重要，因为许多传统疗法，例如化疗药物或表观遗传药物，远非靶向特异性。
表观遗传沉默基因的可及性
早期对表观遗传编辑的研究指出，结合效率是激活表观遗传沉默基因的限制因素，因为异染色质对表观遗传编辑器的可及性可能有限（图2c）。大量研究针对这一潜在局限性发现，ATFs和通常较大的直接表观遗传编辑剂均能成功激活沉默的基因，包括胎儿基因和肿瘤抑制基因。尽管这些研究证实，异染色质不会阻止表观遗传编辑因子的进入，但它确实会影响动力学、结合力和基因组编辑结果。事实上，联合靶向转录激活因子或使用表观遗传药物等组合方法，可以提高Cas9在沉默的异染色质位点的活性，并且可能也可用于提高表观遗传编辑的效率。实际上，表观遗传效应融合蛋白的庞大体积可能会阻碍表观遗传编辑的可及性和效率。解决这一问题的方法包括靶向催化结构域而非全长效应蛋白、使用基于模块的效应蛋白（例如SunTag和MS2）以及使用小型DNA结合域（例如源自锌指蛋白或CRISPR变体的DNA结合域）。
诱导表观遗传重编程的稳定性
直接表观遗传编辑的一大优势在于，表观遗传修饰酶或擦除酶瞬时表达后，基因调控仍能持续进行。这种持续的基因调控与CRISPR基因组编辑一样有效，但避免了永久性基因组改变带来的风险和副作用。直接表观遗传编辑在特定情况下（详见下文）甚至在体内模型中（方框 4）都实现了持续的基因沉默，但预测表观遗传编辑在移除后哪些表观遗传修饰能够维持仍然是一个挑战（图 2d）。揭示表观遗传编辑维持的确切机制是基础研究和转化应用领域的一个活跃研究方向。
高胆固醇血症表观遗传编辑的临床前里程碑
一系列针对PCSK9的突破性研究已确立表观遗传编辑作为治疗高胆固醇血症的有效策略。PCSK9促进LDL受体降解，从而升高胆固醇水平。这些研究利用靶向DNA甲基化和间接组蛋白抑制来沉默PCSK9，从而在不改变DNA序列的情况下实现持久的基因调控。首次在体内靶向沉默以降低胆固醇的研究表明，可以使用腺相关病毒（AAV）递送的CRISPR-dSaCas9-KRAB系统进行长期表达，以抑制小鼠体内的PCSK9表达。血清胆固醇水平至少降低了24周。这是首次证明转录抑制可以作为治疗高胆固醇血症的有效方法。
将 KRAB 与 DNA 甲基转移酶 3A 和 3L(DNMT3A3L) 以锌指融合蛋白（称为进化工程转录抑制因子 (EvoETR)）结合，并通过脂质纳米颗粒 (LNP) 以 mRNA 形式递送，单次给药即可将 PCSK9 水平降低约 50%，且效果持续近 1 年——即使在肝脏再生后——这表明表观遗传标记具有有丝分裂稳定性。
将这项技术应用于灵长类动物，使用 LNP 递送与 KRAB、DNMT3A和 DNMT3L (DNMT3A3L) 融合的CRISPR-dCas9，可使食蟹猴循环 PCSK9 水平降低约 90%，LDL 胆固醇水平降低约70%，且效果至少持续 1 年。值得注意的是，使用dCas9-TET1 激活剂可以完全逆转基因沉默。
有趣的是，在独立研究中，使用另一种表观遗传效应因子（转录激活因子样效应因子 (TALE)-MQ1，以 mRNA 形式通过 LNP 递送）和另一种 Cas 变体（OMEGAoff，通过 AAV76 递送）也证实了 PSCD9 的体内长期沉默。
这些研究共同标志着一个转折点：无需基因组修饰即可实现可编程、持久且可逆的基因沉默，正朝着临床应用迈进。
当靶点是细胞身份的主调控因子时，评估表观遗传编辑后的稳定性可能会变得复杂，例如在细胞分化模型中。在这些情况下，当靶基因影响全局表观基因组和基因调控⽹络时，直接表观遗传编辑因子（甚至是ATFs）的瞬时表达即可产生持续效应。例如，在胚胎⼲细胞中，瞬时表达ATF dCas-VPR激活两个基因就足以诱导自组织形成可重复的胚胎模型。类似地，ATF dCas9-VP64激活Sox1可诱导神经元分化。值得注意的是，当Sox1同时被DNA去甲基化酶dCas‑TET1和转录激活因子靶向时，神经元分化效率更高。尽管这些结果为再生医学带来了巨大的希望，但其持续效果可归因于细胞分化程序的启动，而无法深入了解目标位点表观遗传编辑的维持。
早期研究表明，靶向启动子的DNA甲基化可导致持续的基因抑制，尽管并非所有基因的反应都相同。在乳腺癌模型中，使用ZF‑DNMT3A（而非ZF‑KRAB）可实现SOX2的持续沉默，而使用dCas9‑DNMT3A3L可维持CDKN2A、RASSF1、HIC1和PTEN的沉默。然而，当ZF‑DNMT3A靶向VEGFA时，并未观察到持续效应。使用具有广泛结合能力的ZF‑DNMT3A进行的全基因组DNA甲基化研究进一步证实了DNA甲基化的维持具有情境依赖性，并阐明了该现象的一般特征。首先，DNA甲基化在至少1周内维持在约25%的靶位点。第二，维持与抑制性H3K27me3的基础富集相关，这可能与靶向DNA甲基化协同作用，实现稳定的基因沉默。第三，DNA甲基化丢失速率是可变的，反映了转录因子激活剂和TET去甲基酶的动态募集。在激活转录因子存在的情况下，证明有效基因沉默的一个巧妙方法是，通过特异性地进行DNA甲基化来沉默突变等位基因，同时允许野生型等位基因保持活性。尽管这种针对SNP的沉默（以及激活）在表观遗传编辑剂稀释后，仍能在部分位点上维持数天，但仍需进行更长时间的测量以确定表观遗传记忆。这种等位基因特异性表观遗传编辑具有许多潜在的临床应用，包括沉默显性癌基因和纠正异常印记模式。
与抑制通路在维持表观遗传记忆中的协同作用一致，组合靶向抑制性表观遗传编辑可增强基因沉默的维持。一项开创性研究表明，在K562细胞中，使用dCas9或TALE DBDs组合靶向B2M、IFNAR1和VEGFA后，KRAB和DNMT3A3L对维持具有协同效应。类似地，靶向CXCR4和PDCD1/LAG3的KRAB-TALE-DNMT3A3L融合蛋白在T细胞中导致持续的基因沉默，但当靶向CCR5启动子时，仅获得短暂的沉默，这再次表明维持具有环境特异性。该领域的突破是CRISPRoff的引入，它是一种一体化的KRAB‑dCas9‑DNMT3A3L融合蛋白；首次使用该组合进行的全基因组生长筛选诱导了许多基因的持续抑制。然而，一些基因无法通过瞬时CRISPRoff靶向稳定沉默。有趣的是，将dCas9–KRAB（与H3K9me3相关）与dCas9–Ezh2（写入H3K37me3）交换，可以在某些dCas9–KRAB/dCas9–DNMT3A和DNMT3L无反应基因中诱导持续效应。尽管KRAB经常被纳入其中，但仅使用DNA甲基转移酶进行直接表观遗传编辑表明，在某些情况下，包括体内（例如非分裂脑细胞和肝脏），可以实现维持。
尽管表观遗传编辑在维持基因沉默方面取得了成功（参见方框4），但稳定的基因激活可能更具挑战性，因为这不仅需要写入激活标记和擦除现有的抑制标记，还需要内源性转录因子结合以募集转录机制并抑制异染色质的形成。事实上，一种有效的持续基因激活策略是编辑启动子DNA序列，以引入内源性转录因子的结合位点。当内源性激活转录因子已经存在时，例如通过CRISPRoff等方法沉默的基因，使用dCas9-TET1进行表观遗传编辑以去除DNA甲基化可以导致持续的基因重新激活。这种方法最近在小鼠中得到了证实，证明了表观遗传基因沉默的可逆性。尽管DNA甲基化沉默基因的上调可通过与TET1共同募集p65-RTA或VPR来改善，但这些间接效应因子并不能显著提高活化维持能力。瞬时dCas9-TET1-CD表达诱导的稳定再活化也已在人T细胞中FOXP3表达相关的增强子区域得到证实，尽管这种持续的去甲基化状态不足以诱导稳定的CD4+调节性T细胞表型。在这方面，在小鼠原代T细胞中，慢病毒TET1诱导的Foxp3增强子区域的去甲基化也未能导致稳定的基因表达（与慢病毒表达的靶向启动子的dCas9-p300相反）。印记基因可能特别有利于维持激活状态，因为表达所需的所有转录因子和辅助因子都存在并驱动着姊妹等位基因。在这方面，最近一项研究证实，对一个受抑制基因座的一个等位基因进行去甲基化可以导致基因的持续重新表达。一项针对普拉德-威利综合征中异常印记的SNRPN基因的有前景的临床前研究发现，通过dCas9-TET1进行的DNA去甲基化可以维持激活状态长达7周，甚至在神经元分化过程中也是如此。这些例子表明，在某些情况下，去除DNA甲基化可以导致表观遗传基因的持续激活。
除了DNA去甲基化之外，活性组蛋白修饰的表观遗传编辑也能维持转录激活，但其效果也取决于具体情况。例如，将H3K4me3写入酶PRDM9瞬时募集到未发生DNA甲基化的基因上，可导致基因持续激活；而靶向DNA甲基化的沉默靶基因则仅导致瞬时激活。有趣的是，将dCas9‑PRDM9与dCas9‑DOT1L（可写入H3K79me2）共同靶向DNA甲基化位点似乎能增强这种维持作用。除了基因位点变异外，沉默和激活的表观遗传记忆也因细胞类型而异，尽管其规律尚待确定。维持这种沉默所需的内源性转录因子和染色质调节因子的可用性可能是关键因素。例如，最近一项研究表明，在胚胎⼲细胞中删除染色质因子DPPA2可增强KRAB介导的基因沉默的持久性。
最终，已发表的研究表明，通过指定效应因子、基因位点和细胞类型，可以实现持续的表观遗传编辑。现在的挑战在于预测这种响应性，而寻找通用规则以及开发作用于特定（治疗性）基因位点的结构域组合仍然是当前研究的热点。
动物研究中直接表观遗传编辑的治疗前景
前文讨论的研究凸显了表观遗传编辑作为一种多功能体外研究工具的强大优势。然而，其在动物模型中的有效性也得到了广泛的研究。体内表观遗传编辑已被证明对于明确特定表观遗传修饰与疾病相关基因失调的直接因果关系至关重要；并且有助于区分单个基因位点表观遗传修饰的直接效应和全基因组改变的效应。此外，许多体内研究也证实了表观遗传编辑作为一种治疗策略的潜力。
以下综述了体内表观遗传编辑的研究，重点关注直接表观遗传编辑器。这些研究可分为四类（表3和图3）。第一类涉及通过转基因表达表观遗传编辑器构建的动物模型。第二类涉及由经表观遗传编辑器瞬时处理的胚胎⼲细胞衍生的动物模型。第三类涉及移植经表观遗传编辑器体外重编程的细胞。第四类涉及将表观遗传编辑器应用于疾病模型。
第一类和第二类研究
许多转基因小鼠已被构建为组成型或诱导型表达dCas，但这些方法主要利用间接表观遗传编辑技术，通过靶向转录激活因子（如VP64或其衍生物，例如dCas-VPR在神经元或心肌细胞中表达受限的小鼠）或转录抑制因子（如KRAB）来调控特定基因的表达，而无需直接修饰表观基因组。一项值得注意的研究将dCas9-KRAB转基因小鼠模型与sgRNA-MS2和MCP-LSD1的病毒表达相结合，其中MCP与sgRNA分子中的MS2序列结合，以研究增强子调控造血的功能。该三方抑制系统消耗了染色质修饰H3K4me1，并间接消耗了H3K27ac，同时富集了抑制性H3K9me3，尤其是在靶向增强子处。
此外，Cas9转基因小鼠已被用于来研究间接调控基因表达的表观遗传编辑，通过递送截短的sgRNA阻止DNA切割，例如，MS2系统募集HP1a‑KRAB来沉默Myd88基因。这种方法也已应用于猪模型中的基因激活，该模型使用Dox诱导型SpCas9和截短的sgRNA，并利用MS2‑p65‑HSF1 (MPH)系统；与啮齿动物相比，猪的免疫系统更加接近人类，因此是有价值的动物模型。表达直接表观遗传编辑的转基因模型将成为研究体内疾病相关基因表观遗传调控的宝贵工具，因为它可以克服病毒递送因表观遗传编辑分子体积较大而造成的尺寸限制。据我们所知，目前仅有少数转基因动物模型被报道用于评估直接表观遗传编辑融合构建体的效果。
第一个此类转基因模型表达了dCas9–SunTag，将Tet1靶向H19基因，以模拟Silver–Russell综合征。类似地，有报道称，一种转基因动物模型利用神经元特异性启动子将dCas‑SunTag（募集DNMT3A）的表达限制在神经元中。该模型表达靶向Snrpn的sgRNA后，成功用于缓解Angelman综合征的表型。另一种表观遗传编辑转基因模型表达Cre依赖的dCas9‑p300，从而实现对dCas9‑p300表达的时间和区域控制。令人鼓舞的是，将 Cre 和Pdx1 sgRNA 通过AAV 递送至 dCas9-p300 小鼠肝脏可增加Pdx1 mRNA 和蛋白水平，并伴随Pdx1 基因座 H3K27Ac 的富集。然而，研究报道了脱靶差异基因表达，且即使在没有 Cre 或 sgRNA 表达的情况下，H3K27Ac富集仍然普遍存在。这种非特异性基因激活可能是由于 p300 组成型活性催化结构域的“泄漏”表达所致；其他研究也报道了 p300 的非特异性作用。
另一种构建表观遗传疾病动物模型的方法是，在早期发育阶段瞬时表达表观遗传编辑因子，以诱导目标基因（表3中的II类）发生持久的表观遗传重编程。例如，靶向DNA去甲基化或甲基化可以模拟印记疾病、自闭症和神经发育障碍。令人兴奋的是，通过使用dCas9‑Dnmt3a和dCpf1‑Tet1同时靶向8个基因座印记控制区域，分别下调或上调其靶基因，可以将mRNA与其相应的sgRNA共递送至未受精卵母细胞，从而获得可存活的后代，尽管效率较低。据我们所知，目前尚无尝试使用直接组蛋白表观遗传编辑构建动物疾病模型。
四项超越传统动物模型的研究揭示了利用直接表观遗传编辑技术研究物种特异性表观遗传调控机制的方法，这些研究分别应用了dCas9-Dnmt7和dCas9-Tet2在斑马鱼胚胎中、dCas9-SunTag-DNMT3A在蜗牛中、dCas9-olEzh2在日本鳉鱼中以及dCas9-LSD1在鸡胚胎中。尽管这些研究并未将其用作动物疾病模型，但它们凸显了早期胚胎或发育阶段表观遗传编辑技术在构建不同物种疾病模型方面的潜在应用价值。
转基因模型和早期胚胎表达模型均不足以证明表观遗传编辑的治疗效果。为了证明基因靶向DNA或组蛋白修饰的真正治疗效果，表观遗传编辑器的瞬时表达必须能够特异性且稳定地修饰表观基因组，有效调控基因表达并挽救疾病表型。为了阐明直接表观遗传编辑的治疗前景，下文将首先回顾体外表观遗传重编程细胞的移植研究（表3中标记为III类），其次回顾体内递送表观遗传编辑器的治疗效果（IV类）（图3）。
第三类研究
鉴于在体内高效且细胞类型特异性地递送大尺寸催化表观遗传编辑分子的挑战，通过表观遗传编辑在体外重编程细胞，然后移植重编程后的细胞，为某些疾病开辟了新的研究和治疗途径（表3）。例如，移植经TALE-TET1重编程的β细胞以诱导β细胞增殖，在糖尿病治疗方面极具前景，目前正在探索其他途径。此外，将表观遗传编辑的造血干细胞移植到小鼠骨髓后，结果表明靶向DNA甲基化在分化过程中得以维持，从而可以研究沉默p15对造血的影响。大多数描述直接表观遗传编辑细胞异种移植的研究都集中在肿瘤学和神经退行性疾病领域（表3），如下所述。
在肿瘤学领域，疾病模型通常通过以下方法获得：将肿瘤细胞注射到动物体内，在异种移植前进行基因操作，以评估干预措施的功能效应。DNA甲基化编辑的效果已在体内得到证实，方法是使用经过基因工程改造的肿瘤细胞系，这些细胞系能够稳定表达ZF-DNMT3A、TALE-TET1或dCas融合蛋白。重要的是，CRISPRoff的瞬时表达能够沉默MGMT的表达，并使脑内注射的原发性胶质母细胞瘤细胞对替莫唑胺更加敏感。这些研究均支持直接表观遗传编辑单个癌症相关基因（见表3）（单独或与化学药物联合使用）的治疗意义，从而降低肿瘤的侵袭性。
通过直接表观遗传编辑组蛋白修饰，也已证实了调控单个癌症相关基因表达的治疗潜力。例如，注射稳定表达dCas9‑p300的复发性肿瘤细胞以激活Par4，可抑制乳腺癌肿瘤生长并提高生存率。鉴于Par4表观遗传编辑可增强肿瘤细胞对化疗的敏感性，即使是短暂的Par4激活也可能提高现有疗法的疗效。一项针对小鼠结直肠癌的研究应用慢病毒表达dCas9‑HDAC3来降低Dpp4启动子H3K27ac的水平，从而降低Dpp4的表达、肿瘤大小以及最重要的降低死亡率。在这些研究中，表观遗传编辑稳定表达，因此，需要进行进一步的研究来确定表观遗传编辑的持久性和长期治疗潜力。
体外移植研究也探索了表观遗传编辑在神经发育疾病（例如雷特(Rett)综合征和脆性X综合征(FXS)）中的应用。这些疾病的特征是关键发育基因（分别为MECP2和FMR1）的表观遗传失调，临床前研究显示直接表观遗传编辑在这些基因中具有应用前景。在FXS小鼠模型中，Fmr1表达受到抑制，而移植经靶向Fmr1的dCas9-TET1处理的体外诱导多能⼲细胞可以挽救该小鼠的表型。他们早期利用报告基因小鼠进行的研究具有两项关键的转化意义。首先，直接的表观遗传编辑足以激活FXS小鼠模型培养的有丝分裂后神经元中的Fmr1表达。这一点值得注意，因为重复序列扩增的FMR1处于异染色质状态，转录受到抑制。其次，在胚胎细胞中持续表达dCas9‑TET1和sgRNA的慢病毒足以维持神经元中Fmr1的持续激活，即使在移植后长达3个月也是如此。这种持续激活表明，在dCas9‑TET1存在的情况下，Fmr1的内源性抑制机制并未凌驾于表观遗传编辑之上。由于该构建体是通过慢病毒递送稳定表达的，因此尚不清楚瞬时表观遗传编辑是否会产生类似的效果。未来需要开展研究，以利用瞬时递送方法在体内维持Fmr1的直接表观遗传编辑。一项补充研究将表观遗传编辑应用于来自Rett综合征患者的人类胚胎⼲细胞（ES细胞），这些患者的X连锁MECP2基因的一个等位基因发生了突变。靶向失活X染色体上野生型MECP2的dCas9-TET1足以去除MECP2的甲基并激活其表达，从而挽救人类ES细胞衍生神经元的缺陷。尽管后一项研究并未将编辑后的神经元移植到Rett综合征小鼠模型中，但这些研究强调了表观遗传编辑在神经发育疾病中的巨大治疗潜力。
总之，我们对表观遗传编辑的理解随着体外重编程细胞移植研究和疾病动物模型的构建而不断加深。例如，对原始细胞进行体外重编程，用于再生医学，是表观遗传编辑的另一项强大应用，但表观遗传编辑的真正潜力在于对体细胞疾病细胞进行重编程。下文将全面总结直接表观遗传编辑剂（IV类）在各种临床前疾病模型中的治疗效果，并重点介绍瞬时递送表观遗传编辑剂后疗效的持久性（表3）。
第四类研究
组蛋白修饰的编辑。体内表观遗传编辑最初是通过直接重写组蛋白修饰而发现的，并应用于精神疾病的研究。抑郁症和成瘾这两种高度普遍的精神疾病反映了内侧皮质边缘回路的功能失调，是由潜在的表观遗传和/或遗传易感性与长期暴露于压力或药物之间的相互作用引起的。开创性的临床前研究已证实，在体内可以直接对Fosb基因进行表观遗传编辑，该基因编码成瘾和抑郁症的关键转录因子。在小鼠脑中瞬时表达Fosb‑ZF‑G9a可阻断可卡因诱导的Fosb表达和奖赏行为及攻击性降低。这些行为效应的持久性尚不清楚，因为所有这些效应都是在表观遗传编辑器的瞬时表达期间测量的。
活动诱导的即刻早期基因（如Fosb）的瞬时表达是神经元可塑性的关键机制，并伴随着即刻早期基因启动子的瞬时乙酰化。包括Arc、Fos、Fosb、Nr4a1和Npas4在内的这些基因是神经表观遗传编辑文献中的重要靶点。在小鼠海⻢中利用dCas9‑HDAC8对Fos进行表观遗传编辑，可减少高表达Fos的海⻢神经元数量。一项后续研究利用dCas9‑p300转基因小鼠靶向Fos增强子的乙酰化，结果显示内源性神经元生理功能和信号传导增强。为了应对脑组织中数千种相互交织的异质细胞类型，近期研究在小鼠脑中应用了细胞类型特异性的表观遗传编辑器表达。神经元亚型特异性的瞬时表达Fosb‑ZF‑G9a足以在Fosb‑ZF‑G9a表观遗传编辑器表达后至少4天内诱导抑郁样行为。
大脑中即刻早期基因的激活会导致下游靶基因的激活，而这些靶基因对于神经元可塑性至关重要。Fosb的一个靶基因是Cdk5，它编码一种神经元特异性激酶，该激酶参与奖赏加工、应激和记忆。利用Cdk5-ZF–G9a进行表观遗传编辑，研究人员在创伤后应激障碍(PTSD)、可卡因奖赏和应激小鼠模型中确定了Cdk5的表观遗传调控。最后，一项针对酒精使用障碍的研究将dCas9–p300靶向一个关键的即刻早期基因增强子Arc。dCas9–p300增加了Arc mRNA、Arc启动子H3K27Ac、Arc SARE增强子RNA(eRNA)的水平，以及Arc SARE与Arc之间的相互作用强度，挽救酒精暴露的行为影响。
除了精神疾病之外，一项早期的体内脑研究应用靶向SUV39H1，通过H3K9me3富集来抑制Psd95的表达。这种抑制足以在体内调节海⻢神经元的突触和棘突成熟。鉴于FSHD是由DUX4的表观遗传去抑制引起的，因此它是表观遗传编辑的另一个关键疾病靶点。利用SUV39H1 SET结构域进行表观遗传编辑以抑制Dux4，可以挽救FSHD小鼠模型的表型。最后，CRISPR‑dCas9-p300增加了肝细胞中B4galnt2的表达以及阿尔茨海默病小鼠模型中神经元Gad1的表达，从而改善了记忆缺陷。
这些研究表明，通过组蛋白表观遗传编辑调控单个基因的表达，从而干扰疾病的发病机制，具有巨大的潜力。尽管染色质对基因表达的调控已得到充分证实，但最近的研究发现，某些组蛋白修饰也能强烈预测可变剪接。表观遗传编辑非常适合用于阐明表观基因组在可变剪接中的功能作用。在小鼠脑中，dCas9-SET2的表达能够富集靶位点的H3K36me3，从而驱动Srsf11的可变剪接，并增强可卡因奖赏行为。重要的是，在这些案例中，表观遗传编辑调控可变剪接，而没有改变基因表达水平。
DNA甲基化编辑。多种递送方法已被用于诱导大脑中的DNA去甲基化或甲基化编辑（详见表3）。阿尔茨海默病临床前模型包括通过慢病毒递送dCas9‑TET1，从而解除对组织蛋白酶D的抑制，进而降解β‑淀粉样蛋白（Aβ）；或递送dCas9‑DNMT3a，从而沉默App（编码Aβ前体蛋白）。鼻内给药含有靶向Bace1（编码β‑分泌酶1）的dCas9‑DNMT3A核糖核蛋白的光诱导外泌体，可减少淀粉样蛋白病理并改善识别记忆障碍。在帕金森病的临床前研究中，使用靶向脑的外泌体递送dCas9‑DNMT3A沉默SNCA（编码α‑突触核蛋白）可减轻帕金森病样损伤，而通过质粒递送dCas9‑DNMT3A3L沉默小鼠前额叶皮层的Ttr可减轻抑郁样行为。
直接DNA甲基化编辑在神经系统疾病之外的治疗效果首次得到证实，即通过稳定表达dCas9‑TET3慢病毒诱导Rasal1和Klotho表达，从而改善肾纤维化。此外，研究人员首次评估了在小鼠肝细胞中瞬时表达靶向Fgf21的dCas9‑SunTag‑Tet1进行DNA去甲基化时，即刻编辑的体内维持情况。然而，通过尾静脉注射一体化质粒后，其效果在第14天未能维持。如前所述，效应结构域的组合可能有助于提高表观遗传重编程的维持效果。事实上，CRISPRoff（包含DNMT3A3L和KRAB）使MGMT基因沉默。在原代胶质母细胞瘤细胞中进行瞬时mRNA电穿孔后，移植后至少10天内表达。令人振奋的最新数据表明，使用这三种抑制因子（KRAB、DNMT3A和DNMT3L）作为锌指融合蛋白来沉默Pcsk9，单次静脉注射LNP介导的mRNA后，可有效降低胆固醇水平至少1年（而对于与所有三种蛋白融合的一体化锌指蛋白，则至少可降低43天）。重要的是，这种锌指‑KRAB即使在强制肝脏再生超过2个月后，DNMT3A3L对Pcsk9的沉默作用仍然维持，其效率与传统基因敲除相当。通过瞬时表达与TALE融合的细菌DNA甲基转移酶（MQ1），Pcsk9基因座DNA甲基化诱导的沉默作用的维持时间长达6个月，这一结果已得到独立证实（见方框4）。后续的人源化转基因小鼠和灵长类动物研究不仅验证了表观遗传编辑的效率和持久性，还证明了通过将TET1靶向PCSK9基因座可逆转诱导的基因沉默。重要的是，体内表达恢复至少维持了42天。除肝脏外，最近的研究还证明，通过无载体气道递送与TET1和TDG（胸腺嘧啶DNA糖苷酶）融合的重组蛋白ZF或dCas9/gRNA，靶向Cxcl11，可在肺部持续激活基因表达。通过雾化吸入和鼻内溶液相结合的方法，使小鼠肺上皮细胞中的Cxcl11去甲基化和去抑制，小鼠获得了对⼲扰素‑γ (IFNγ)的反应性。
总之，现有关于体内直接表观遗传编辑的文献支持该方法具有巨大的治疗潜力，尤其是在神经系统疾病、神经退行性疾病和精神疾病方面，早期临床前研究已显示出令人鼓舞的结果。然而，这些研究通常在编辑基因表达期间评估结果，因此对脑组织中直接表观遗传编辑后的表观遗传记忆的了解仍然有限。据我们所知，目前只有一项体内研究评估了脑内的长期效应。在该研究中，将与未修饰的组蛋白H3尾部（H3K4me0）和非催化性DNA甲基转移酶（DNMT3L）结构域融合的锌指蛋白（ZFs）通过腺相关病毒（AAV）递送至脑组织，足以募集内源性DNA甲基转移酶来抑制朊病毒蛋白的表达，从而保护脑组织免受朊病毒引起的病理损伤。由于AAV包含一个自沉默启动子，因此可以确定这种间接诱导的DNA甲基化至少持续13周。然而，对于分裂细胞而言，需要添加KRAB才能维持抑制作用。这一观察结果符合以下概念：根据基因背景的不同，可能需要多种效应结构域的组合才能确保稳健持久的效应。
表观遗传编辑的临床转化
目前至少有14家公司致力于将表观遗传编辑技术应用于临床（表2）。据披露，这些临床工具主要通过靶向DNA甲基化或去甲基化来分别抑制或激活病理基因的表达。
第一个进入临床试验的直接表观遗传编辑工具，即OTX‑2002（Omega Therapeutics10），于2022年11月获得FDA孤儿药资格认定。OTX‑2002可诱导MYC沉默，MYC是一种与超过一半人类癌症有关的癌基因。具体而言，OTX‑2002应用组合表观遗传抑制，使用MYC靶向的ZF‑MQ1和ZF‑KRAB来甲基化DNA，并间接甲基化MYC癌基因附近的组蛋白。遗憾的是，OTX‑2002的评估并未在I/II期MYCHELANGELO I研究之后继续进行，该研究纳入了24名患有肝细胞癌和其他实体瘤的患者。
乙型肝炎病毒（HBV）是表观遗传疗法的另一个关键靶点。Tune‑401（Tune Therapeutics公司）已在西太平洋地区进入临床试验，它利用基于CRISPR的DNA甲基化技术抑制病毒性肝炎基因（包括整合到宿主DNA中的基因和以共价闭合环状DNA (cccDNA)形式存在的游离体基因），从而治疗乙型肝炎。此外，FDA已授予EPI‑321（Epicrispr公司）孤儿药资格，该药物旨在恢复FSHD患者DUX4基因座的DNA甲基化，首例患者于2025年接受治疗。由于Epicrispr使用dCasMINI（dCas12f），其较小的体积使其能够通过腺相关病毒（AAV）进行给药。
多家公司正在研究利用表观遗传编辑技术治疗神经退行性疾病，例如阿尔茨海默病（APOEe4）、杜氏肌营养不良症（UTRN）、肌萎缩侧索硬化症（C9orf72）和面肩肱型肌营养不良症（FSHD，DUX4）。Sangamo Biosciences是DNA靶向领域的先驱公司，已开发出ZF‑KRAB等工具，用于抑制与亨廷顿病相关的突变型HTT。SLS‑004（SEELOS Therapeutics）是一种靶向SNCA的dCas9‑DNMT3A，SNCA编码α‑突触核蛋白，与帕金森病相关。其他处于临床应用阶段的疾病和靶点包括神经发育障碍（UBE3A）、慢性疼痛（SCN9A）和肝病（PSCK9、HNF4a）（详见表2中的参考文献和详细信息）。
表观遗传编辑技术的快速临床转化得益于CRISPR-Cas9基因组编辑平台的成功，该平台在短时间内启动了多项临床试验。这些试验包括首次使用LNP制剂的mRNA进行体内直接给药以治疗转甲状腺素蛋白淀粉样变性，并促成了首个CRISPR药物Casgevy获得监管机构批准，该药物通过编辑启动子DNA序列来上调胎儿血红蛋白的表达。正在进行的CRISPR-Cas9临床试验的结果将解答与表观遗传编辑相关的重要问题，包括疗效和毒性。此外，鉴于观察到的染色体易位和其他与靶向DNA编辑相关的异常，优化表观遗传编辑作为一种非侵入性基因表达调控方法的需求可能变得迫切。此外，过去二十年来使用锌指核酸酶 (ZFNs) 或ZF ATFs的临床试验树立了安全性先例，其安全性可能优于DNA嵌入型CRISPR平台。事实上，一些表观遗传编辑公司正在利用ZFPs或TALEs（表 2）。
递送
为了实现表观遗传编辑工具的体内递送，人们探索了多种方法（框5），包括腺相关病毒（AAV）和脂质纳米颗粒（LNP）。就CRISPR-Cas9编辑工具的递送而言，AAV介导的递送是临床试验中最广泛使用的方法，但其可能由病毒衣壳的免疫反应引起的严重不良反应（包括死亡）显然需要谨慎。例如，一名杜氏肌营养不良症患者在输注高剂量表达dSaCas9-VP64的AAV9后死亡，死因是全身性先天免疫毒性，这种毒性可能由载体引起，但也可能与VP64的表达有关。此外，使用AAV递送转基因时，转基因的长期表达可能会增加脱靶效应；通过使用诱导系统（例如，缺氧反应）或Cas9抑制剂，可以将表观遗传编辑的表达限制在特定的时间窗口内，从而减轻这些影响。此外，转基因的AAV大小限制（4.7 kb）阻碍了其在表观遗传编辑中的应用，因为通常需要将较大的效应结构域与已经很大的dCas9融合。目前正在探索旨在解决这一限制的方案，包括基于mRNA反式剪接重组的双AAV载体技术和更小的Cas变体。最近，一项巧妙的研究通过递送与未修饰的组蛋白H3尾部(H3K4me0)和非催化DNA甲基转移酶(DNMT3L)结构域融合的锌指蛋白(ZF)来募集内源性DNA甲基转移酶，从而规避了AAV载荷大小的限制。
表观遗传编辑工具体内递送的里程碑事件
2014年一痘病毒首次实现体内表观遗传编辑。单纯疱疹病毒(HSV)可通过短暂递送锌指蛋白(ZF)-G9a来抑制小鼠模型中的Fosb基因表达，从而展示了通过组蛋白甲基化实现强效位点特异性沉默的过程。
2016年一胎内电穿孔 在子宫内对一种集成式 CRISPR-dCas9-SunTag-Tet1;Gfap 单向导RNA(sgRNA)进行电穿孔处理后，当将其递送至胚胎发育第14.5天小鼠胚胎的侧脑室时，能够抑制 Gfap-GFP 报告基因的表达。这一应用与发育障碍(如 Angelman 综合征和脆性X染色体综合征)中的表观遗传调控机制相关。
2016年一慢病毒 利用慢病毒载体将 CRISPR-dCas9-Tet1 递送至表达一种对甲基化敏感的绿色荧光蛋白报告基因的转基因小鼠体内。通过向皮肤真皮细胞和脑组织内注射 CRISPR-dCas9-Tet1，绿色荧光蛋白的表达被激活。2018 年，这一方法被应用于大脑中，以在小鼠脆弱X综合征模型中解除 FMRP 的抑制状态。
2020年一水动力尾静脉注射 采用水动力尾静脉注射法，将一种全整合质粒递送CRISPR-dCas9-SunTag-Tet1;Fgf21-sgRNA，可短暂去甲基化并激活小鼠肝细胞中的Fgf21基因。
2021年一细胞递送 借助 ZF-KRAB 技术，该研究描述了一种颇具前景的平台，可用于分泌构建物(可轻松应用于表观遗传编辑剂的递送)。植入细胞表达基于 ZF 的人工转录因子，能够调节周围组织中的基因表达。
2022年一脂质纳米颗粒 脂质纳米颗粒(LNPs)封装B4galnt2-sgRNA或用于dCas9-VP64、dCas9-p300、dCas9-VPH-SS18(VP64-D65-HSF1-SWI/SNF)的合成mRNA，能够在活体条件下激活肝脏细胞中的B4galnt2基因。将sgRNA与dCas9合成mRNA分别进行封装，随后注射混合LNPs制剂，这种方法所实现的肝脏递送效率较使用混合dCas9合成mRNA和sgRNA的LNPs制剂提高了两倍。
2024年一外泌体(非病毒) 鼻内递送dCas9-DNMT3A核糖核蛋白靶向Bace1，减少阿尔茨海默病小鼠模型中的淀粉样病理。
2024年一自灭活型AAV 首次使用一种自动静默的阿诺-相关病毒(AAV)载体。此举使得能够短暂表达与未经修饰的组蛋白H3尾巴(H3K4me0)相连的 ZFs 以及一个非催化性 DNA 甲基转移酶(DNMT3L)功能区(CHARM)。这一过程能够招募内源性 DNMT3A 来抑制 Prnp 在一种朊病毒疾病模型中的表达，从而降低长期编辑表达的风险并规避 AAV 载体的货载量限制，适用于直接进行表观遗传学编辑。
2025年一重组蛋白递送 针对六种 ZF 阵列或六种 CRISPR 实例所研发的重组蛋白表观遗传学编辑器“biologics”，能够招募 DNA 去甲基化酶、TDG和Tet作用于Cxcl11。通过鼻内和雾化给药方式，这些制剂在小鼠肺上皮细胞中实现了Cxcl11的去甲基化和去抑制作用。
2025年一LNPs: 临床转化 首次在灵长类动物中展示了具有临床实用价值的、持久的表观遗传编辑技术。Tremblay等借助LNPs递送的基于dCas 的表观遗传编辑工具靶向PCSK9，在非人灵长类动物中实现了对低密度脂蛋白胆固醇的持久性降低，且表现出显著的疗效和可逆性。这代表着一项重大的转化医学里程碑。
重要研究发现，某些腺相关病毒（AAV）能够有效地将Cas9工具递送至多种物种，从而促进转化研究。而诸如一体化自灭活AAV载体等改进方案的出现，无疑将推动该领域的发展。与此同时，其他递送平台也正在被探索，例如慢病毒，其有效载荷更大（约8‑10 kb），并可实现组织特异性一体化递送。此外，其他非病毒递送方法也在研究中，包括工程细胞、支架、病毒样颗粒和重组蛋白。
继LNP介导的mRNA递送成功应用于严重急性呼吸综合征冠状病毒2 (SARS-CoV-2)疫苗之后，利用LNP递送RNA的方法受到了广泛关注，并正在临床试验中探索其在基因组编辑方面的应用。该方法已被证明可有效递送表观遗传编辑工具。并用于OTX‑2002的临床研究（NCT05497453）。其他配方，例如使用两种不同的LNP配方（编码dCas9融合蛋白的mRNA与sgRNA），以防止引导RNA优先于mRNA被包裹，可能进一步提高疗效。此外，引入靶向配体以诱导LNP在目标组织中的摄取也有助于提高特异性，其低免疫原性使得CRISPR‑Cas9可以重复给药而不会引起免疫问题。此外，在sgRNA递送方面，人们正在研究各种方法来增强其稳定性、分布和细胞摄取，包括化学修饰和使用化学稳定的保护性寡核苷酸。
结论与展望
继2003年首次报道直接内源性表观遗传编辑调控基因表达之后，十年间后续研究陆续发表。近几年，该领域取得了显著进展，研究表明表观遗传编辑具有靶向特异性、高效性、情境依赖性、可持续性和临床前治疗效果。此外，表观遗传编辑已成为一种强大的“即用即停”策略，可在不改变基因组序列的情况下实现多重双向表达调控。尽管取得了这些进展，我们也认识到因果关系的规律并非总是简单的，并且我们开始逐渐理解其可持续性的规则。除了加深对表观遗传重编程规则的理解和改进递送方式外，识别预测患者对表观遗传编辑反应的生物标志物对于确保有效的临床试验可能至关重要。除了这些基本考量之外，进一步普及CRISPR技术及其表观遗传学的伦理意义对于该技术的进步至关重要。尽管表观遗传编辑被认为比DNA序列编辑侵入性更小，且可能更容易逆转，但两者都对人类健康和进化构成潜在⻛险。与基因序列编辑相比，由于胚胎发生过程中的擦除波和表观遗传重编程，表观遗传编辑的遗传性要低得多。尽管在小鼠中已证实基因靶向甲基化及其相关表型可以跨代遗传，但这可能与实验诱导的DNA瘢痕有关。对表观遗传编辑技术进行严谨负责的创新，应能确保这种强大而用途广泛的新型治疗方法的安全应用。
Heller, E.A., Bintu, L. & Rots, M.G. Epigenetic editing: from concept to clinic. Nat Rev Drug Discov (2025). https://doi.org/10.1038/s41573-025-01323-0
