从qPCR溶解曲线判断PCR产物的相对大小

在做qPCR的时候,40个循环之后,都会插入一步(6):绘制溶解曲线。

Fig1.PNG

结束以后会出现下面的结果
Fig2.PNG

RFU为荧光单位,随着温度的升高,荧光值一直在下降,表明DNA双链在变性成为单链,但是下降速率却是不一样的,如绿色的线大概在85°后下降变快,蓝色和红色的线却在85°前下降变快,求它的导数(-d(RFU)/dT)即为对应的下降速率,如下图:
Fig3.PNG

那么,溶解峰会给我们提供什么信息呢?

上图的三种颜色代表了我三种不同的PCR产物片段(3个基因)
从左至右依次(产物名称,产物大小,GC含量,GC碱基对):
A(蓝色),141bp,59%,84
B(红色),138bp,61%,85
C(绿色),169bp,58%,99
结果会发现,溶解温度与产物的含有的GC碱基对数是正相关的(应该不是线性相关)
如果三个产物的GC含量一样,那么就可以大致判断,A<B<C,对应的他们的GC碱基对数:A<B<C
溶解峰单一表明PCR产物特异性好,
最大峰处对应的温度为PCR产物(不是引物)的Tm值,此时产物DNA片段一半为双链,一半为单链。
此外,PCR形成的引物二聚体溶解峰会在低于80°出现(分子量小)。

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