作为一个科研垃圾，因为足够幸运所以考上了北大，浪费着老板的资源，一天花掉4万块钱都算小事。
ATAC-seq建库实验失败经验总结：
错误点:
- 过磁珠没有按照protocal 进行，主要体现在未离心直接加磁珠，重悬液体积加错，推柱子时没有从磁力架上取下来，直接推下去且没有加任何液体。
- ATAC-seq实验在pcr 的步骤忘记加入DNA聚合酶（TAE）
- 时间分别发生在中午吃完饭后1点（过磁珠），和晚上凌晨1点（ATAC-seq），属于做实验身体上疲惫和心态上着急导致的失误。
- 时间上的失误，早上7点到实验室，从老鼠到磨脾脏计数一直拖到了中午一点，时间花掉6h，其中主要是计数时间拖久了，因为计数过程中不放心所以反复确认同一个样本的总细胞量，本次实验从宏观角度来说，样本量只需要超过2*10^8即可，不需要过于纠结，磁珠后的计数明显更重要。当天开始做ATAC的时间是下午5点，所以过磁珠耽误的时间更长，主要问题出现在重悬液体积加错，5ml的体积过MS柱非常慢，还会直接导致细胞活性降低。ATAC由于开始的时间过晚，到凌晨一点的时候疲乏困倦，导致没注意到pcr扩增第二页的TAE扩增酶，导致产量非常低。
以后需要：
- 做实验前反复核对自己写的protocol有无问题（咨询同组，看商品说明书）。查找到每一个试剂的成分以及用途，好好理解protocol，结合官网说明书。
- word上的任何表格文字千万不能分两页放，word的文字整齐度非常重要。
- 实验前盲目自信，实验中手忙脚乱。细节问题未得到解决，比如加样如何更快更精确，比如在合适的时间节点标注样本管合适，比如做完上一步要脑子里面想清楚下一步做什么，并且看清楚protocal再做。如何更科学管理好实验中每一步的时间？
- 做实验的时候每一步都快速思考一下原理，确保一下试剂存在于体系中，感受一下每一步样本发生了什么理化性质的变化。
- 对protocal的熟悉程度不够，需要大样本练习，比如6只老鼠进行模拟操作大样本训练？
- ATAC-seq 的模板在进行pcr之后，如果浓度很高的情况下，可以保存两份，备份防止后半部分出错还有补救的机会？pcr之后可以做双链浓度检测，确保pcr成功？
- 标注管子学习，名字非常长的情况下，用编号标注，做好记录即可，否则浪费时间还看不清楚。
- 柱子上务必也同时做好标记，不要直接按照顺序排列，这样做可以在过柱子失败的情况下，溯源回去重新过柱子，不会造成太多损失。
- 做实验任何怀疑，拿不准的时候立刻汇报师姐，确保损失减少到最低。另外注意注意沟通的态度问题。
并思考一个问题，在没有加入TAE扩增酶的情况下，已经做了片段筛选，还能回去重新进行pcr扩增，重新筛选吗？
1.ATAC-seq的Tn5转座酶作用？
转座酶识别序列： AGATGTGTATAAGAGACAG、第一接头序列：AATGATACGGCGACCACCGAGATCTACACXXXXXXXXTCGTCG GCAGCGTC；第二接头序列：CAAGCAGAAGACGGCATACGAGATXXXXXXXXGTCTCGTGGGCTCGG；其中， XXXXXXXX为Index序列。
给目的片段的两条链两端各添加一段带着缺口的接头，在pcr的72℃的延伸过程中，index会在TAE酶的作用下进入到缺口中，在不加TAE的情况下，index 连接不上，转座酶的序列也连接不上，在后续的过滤片段长短的过程中会清除掉全部的Tn5转座酶的序列，再次进行pcr并没有作用，再次进行pcr会导致产物中全部都是引物的二聚体。
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2.双端的接头是136，Tn5切割最小是40bp，加上接头后文库的长度最多在180-200bp，核小体是150-200bp，出现三个峰值并递减。
3.在pcr体系中，不加TAE酶，在复苏过程中发生了什么变化，双链DNA会复苏吗？氢键的断裂后修复这个过程进行16个循环，在没有酶的作用下双链复合效率会非常低。
综上不能。
