糖尿病肾病(DKD)发生在~40%的糖尿病患者中，并会导致肾衰竭和心血管疾病。研究者使用单细胞核转录组测序(snRNA-seq)分析了小鼠DKD模型的五种治疗方案。百万级别的细胞图谱显示，所有肾细胞类型对DKD及其治疗均有异质反应。单一疗法和联合疗法针对不同的细胞类型，并诱导了明显的转录变化。钠-葡萄糖协同转运蛋白2抑制剂(SGLT2i)在近端小管S1段的早期影响表明，这类药物可以诱导禁食模拟和缺氧反应。糖尿病肾病模型中近端小管中剪接体调节蛋白丝氨酸/精氨酸丰富剪接因子7 (Srsf7)下调，该因子又可被SGLT2i特异性回复。在体外，近端小管敲除Srsf7诱导了一种促炎症表型，这意味着可变剪接是DKD的驱动因素，表明了SGLT2i调控近端小管的可变剪接是这类药物的潜在作用机制。
文章题目：Mapping the single-cell transcriptomic response of murine diabetic kidney disease to therapies
中文题目：关于小鼠糖尿病肾病治疗的单细胞转录组图谱
见刊时间：2022.07
期刊名称：Cell Metabolism
影响因子：31.373
实验平台：10x Chromium 单细胞核转录组测序
DOI：10.1016/j.cmet.2022.05.010
研究内容
小鼠肾脏中的细胞异质性
研究者首先构建了小鼠的糖尿病肾病模型，并且通过检测尿白蛋白/肌酐比(UACR)、收缩压(SBP)和葡萄糖来检测模型构建质量。实验共分为7组：db/m (control)、db/db (vehicle)、db/db + ACEi、db/db + Rosi、db/db + SGLT2i、db/db + ACEi + Rosi和db/db +ACEi + SGLT2i。糖尿病肾病小鼠进行相应方式给药后，研究者对UACR, SBP和葡萄糖再次进行检测评价出联合治疗方式比单一治疗方式更佳（如图1）。随后研究者对小鼠肾脏组织用10x Chromium平台进行了单细胞核测序并得到了一共946,660个高质量的单细胞，这些单细胞被分成了18个细胞群。研究者观察到内皮细胞、免疫细胞、TAL细胞和成纤维细胞之间存在显著的异质性。研究者还分别对这四种细胞的亚型进行了鉴定（如图2）。
DKD进展过程中基因的差异表达
研究者为了评估DKD进展过程中的基因表达变化，比较了对照组(db/m)、db/db组和db/db + reninAAV组小鼠在2天和2周的snRNA-seq谱。差异表达基因数量最多的细胞类型包括主细胞(PC)、TAL、顶叶上皮细胞(PECs)、PT和内皮细胞(ECs)。超过一半的差异表达基因仅在单细胞类型中检测到，这显示出糖尿病模型中肾细胞的异质性。随后研究者分析了在这两个时间点异质性最强的两种细胞群中上调和下调的基因。这项分析确定了许多可能作为疾病生物标志物的基因。已知DKD中某些特定肾细胞类型存在差异表达基因，研究者接下来用GWAS识别出慢性肾脏疾病(CKD)相关常见变异是否也与特定的肾脏细胞类型有关。随后利用MAGMA将GWAS估算的肾小球滤过率(eGFR)、蛋白尿和血尿素氮(BUN)与疾病进程中每种细胞类型联系起来。分析结果显示，内皮细胞和收集管细胞(PC和远曲小管[DCT])与eGFR显著相关。PC与CKD显著相关。而PC和EC也为DKD中差异表达基因(DEGs)数量最多的前三种细胞类型（如图3）。
DKD治疗的细胞异质性
接下来，研究者研究了不同的治疗方案在多大程度上可以回复每种细胞类型中由DKD诱导的基因表达变化。研究结果表明：某些细胞类型的转录变化发生在早期，而有些细胞类型则恰恰相反。因此不同治疗方案对细胞类型和时间存在特异性影响。例如，与第14天相比，第2天足细胞、DCT和连接小管(CNT)中的疾病基因被回复的比例更高，而与第2天相比，14天的治疗回复了更多的TAL和DTL中的疾病基因。然而，在PEC、TAL、PC和ICA中，通过Rosi治疗的靶基因和通路是非常不同的，但它们都通过治疗得到了改善。随后研究者对疾病及其治疗过程中细胞间通讯模式及其变化进行了分析。分析结果显示：细胞通讯变化最显著的细胞类型包括足细胞、PT、DTL和TAL。研究者研究了每种治疗方案如何使足细胞、PT和TAL的信号评分标准化：SGLT2i的单独治疗的情况下，PT细胞的评分最好。本分析特异性鉴定了受损PT信号通路与足细胞和成纤维细胞共同分泌的骨桥蛋白(Spp1)。Spp1已被证明通过调节DKD模型中的足细胞信号通路在蛋白尿中发挥重要作用。ACEi + Rosi或ACEi + SGLT2i联合治疗能最好地抑制骨桥蛋白细胞间信号，这与损伤标志物Havcr1的表达降低相关，进一步强调了联合治疗效果更佳（如图4）。
联合用药治疗PT细胞的损伤
研究者经综合分析确定了一组用于研究的损伤状态的近端小管细胞(注释为“inji .PT”)，其表达典型的标志物：Havcr1、Vcam1和C3。联合用药可显著降低DKD中PT损伤标志物Havcr1的异常上调，并且比单一用药效果好。对小鼠样本进行Bulk RNA-seq，并证实联合治疗在降低损伤PT细胞比例方面最有效。研究者进一步比较了联合治疗组与单一治疗组糖尿病肾损伤PT的基因表达变化。该分析显示，单一药物治疗后损伤评分没有显著变化，但联合治疗2周后损伤评分显著下降。作为补充分析，研究者应用了另一种算法(scID)分析后显示：两种药物联合治疗后，损伤的PT细胞可以更大比例映射到健康的肾脏细胞(如图5)。
药物治疗对肾小球的反应
研究者首先确定了肾小球亚细胞类型：足细胞（Pod）、系膜细胞(MCs)、GECs和PEC。随后对这四种细胞中的marker基因进行了展示。研究者参考前人研究数据并依据相应细胞类型整理了人类和小鼠DKD共同差异基因表达的列表，从而评估了不同治疗方案对DKD相关基因表达的影响，并再次揭示了异质性。接下来，研究者对介导GEC到足细胞的信号转导的配体受体对进行了研究。结果表明，内皮细胞来源的Bmp6-（Bmpr1b+Bmpr2）信号通路可被糖尿病强烈诱导，而这一信号通路在SGLT2i单独或联合治疗时明显减弱。与Bmp6-（Bmpr1b+Bmpr2）不同，Bmp6-（Bmpr1a+Bmpr2）在GECs中有糖尿病会特异性上调，其受体Bmpr1a在足细胞中高表达（如图6）。
通过比较SGLT2i对PTS1和PTS2的影响，推断SGLT2i的机制
SGLT2i靶向钠-葡萄糖共转运蛋白Slc5a2，该蛋白专一表达于PT S1段的顶膜上。研究者对此进行了证实。随后他们对单一治疗和联合治疗在2周时如何改变S1和S2片段的基因表达进行了分析。证明S1段确为SGLT2抑制的直接靶点。接下来，他们对S1和S2的所有EDG进行GO分析。结果表明，SGLT2i直接诱导S1段的饥饿模拟和缺氧反应。研究者又对S1和S2数据集中EDG进行了分析得出结论：显著上调的因子Srsf7可能参与其中。Srsf7可编码调节mRNA剪接的丝氨酸/精氨酸(SR)剪接体蛋白。有研究表明，Srsf7在小鼠中可以通过调节促进合成代谢和抑制衰老途径的基因的可变剪接来促进幼年转录组基因程序。因此，SGLT2i的一种作用机制可能是调节可变剪接来激活保护性的代谢（补充图，此处未列出）。
研究者证实，只有SGLT2i可回复S1段的Srsf7表达。他们建立体外细胞培养模型[人原代肾PT细胞(RPTEC)]发现：在RPTEC中通过小干扰RNA (siRNA)敲除Srsf7，mRNA和蛋白敲降效率均>80%。对其进行Bulk RNA-seq显示了基因表达的巨大差异。对这些基因变化的通路分析显示，Srsf7基因敲除后，多种促炎因子表达上调，表明Srsf7基因通常在S1段促进健康和抗炎表型。进一步分析显示：许多被SGLT2i回复的基因在Srsf7敲除后也存在差异表达，这提示了我们的体外模型和体内结果之间有一定的机制联系（如图7）。
主要结论
研究者构建了糖尿病肾病小鼠模型并进行不同方式给药处理（共五种），在两个时间点（治疗2天和2周）使用单细胞核测序了百万级别的细胞并进行了相应的分析，分析结果体现了细胞之间的异质性，并且联合治疗要比单一治疗效果更好。研究者的DKD单细胞图谱及其治疗方法将有助于详细探索疾病进展的机制，并更深入地了解目前的治疗方法如何减缓DKD的进展。
参考文献：
Wu H, Villalobos RG, Yao X, Reilly D, Chen T, Rankin M, Myshkin E, Breyer MD, Humphreys BD. Mapping the single-cell transcriptomic response of murine diabetic kidney disease to therapies. Cell Metab. 2022 Jul 5;34(7):1064-1078.e6. doi: 10.1016/j.cmet.2022.05.010. Epub 2022 Jun 15. PMID: 35709763; PMCID: PMC9262852.
