摘要：
免疫治疗是非小细胞肺癌(NSCLC)治疗的主要方法。虽然肿瘤突变负荷(tumor mutational burden, TMB)与免疫治疗应答相关，但对基线免疫应答与肿瘤基因型之间的关系知之甚少。使用单细胞RNA测序，我们分析了来自35个早期NSCLC病变的361,929个细胞。我们确定了一个由PDCD1+CXCL13+活化T细胞、IgG+浆细胞和SPP1+巨噬细胞组成的细胞模块，称为肺癌激活模块(LCAMhi)。我们证实LCAMhi在多个NSCLC队列中富集，并且配对CITE-seq建立了一个抗体面板来识别LCAMhi病变。研究发现LCAM的存在与整体免疫细胞含量无关，与TMB、癌睾丸抗原和TP53突变相关。
即使在TMB高于中位数的患者中，高基线LCAM评分也与增强的非小细胞肺癌对免疫治疗的反应相关，这表明免疫细胞组成虽然与TMB相关，但可能是免疫治疗反应的非冗余生物标志物。
样本情况
使用CITE-seq、scRNA-seq和T细胞受体测序(TCR-seq)生成了三个整合表面标记物抗体谱的数据集(表S2-S4)。我们对8例患者的肿瘤和非肺组织进行了CITE-seq，对另外27例患者进行了scRNA-seq。CITE-seq面板包括15种抗体以验证基于rna的细胞类型注释，并扩展到81种抗体以进行更特异性的研究(表S2)。为了扩大T细胞的注释，我们对三名患者进行了联合scRNA-seq/TCR-seq。
结果
R1Integrative analyses unify phenotypic mappings across substrates and datasets
首先聚类了19个经10X
Chromium 30 V2化学处理的nLung和22个肿瘤样本，然后使用该模型对不同处理样本或不同数据集的细胞进行分类(图S1B-S1D和STAR方法)。基于rna的聚类鉴定了6个区室中的49个免疫簇，包括T细胞、B细胞、浆细胞、肥大细胞、浆细胞样树突状细胞(pDCs)和单核吞噬细胞(MNPs)(参见STAR方法进一步讨论簇注释)。总体而言，来自35个肿瘤和29个匹配的nLung样本的361,929个单细胞被分类为30个注释的转录状态(图1C和S1E-S1G)。
CITE-seq数据使用成熟的蛋白质标记物确认细胞身份(图1D)。例如，pDCs表达与该谱系相关的转录本(LILRA4, IRF8;图1C)和已知的群体定义蛋白(CD123;图1 d)。Tofacilitate sharing of findings, we built an interactive website that enablesexploration of the dataset (https://
scdissector.org/leader).
R2Theintratumoral DC compartment is characterized byexpansion of CD14+/CD163+ DC3
R3 Tumorsare dominated by monocyte-derived MF that are distinct from alveolar MF
R4TCRslimited to tumors mark T cells with distinct phenotypic features
T细胞的CITE-seq分析鉴定出CD8+细胞具有自然杀伤(NK)样特征(TNK-like;集群20)，升高的GZMK (TGZMK;簇1)，组织驻留相关基因(ITGA1转录物和CD103、CD69蛋白);CD8 +测试请求信息;集群48)，以及一个明显激活的集群en，该集群富含IFNG、GZMB、LAG3、CXCL13和HAVCR2转录本，并增加PD-1、ICOS和CD39蛋白(Tactivated;集群44;图4A和4B)。其他细胞簇主要由CD4+细胞组成，可分为Treg(第19簇)、Trm(第50、59簇)、表达与中枢记忆一致的细胞或幼稚细胞(TCM/naive-like- i;簇51,39;TCF7、SELL、LEF1、MAL和CD127)，以及表达该特征和组织驻留特征(TCM/naive-like-II;集群34,53)。
虽然Tactivated和Treg是肿瘤中增加最多的T细胞群(图4C)，但高表达细胞周期基因MKI67和STMN1以及表面蛋白HLA-DR和CD38的簇也增加了(Tcycle;集群18;图4 a-4c)。
(批注：NKcell tumor低于normal)
R5B cells and plasma cellsare increased in tumors, but the B cell/plasma cell ratio is conserved
R6Tumors exhibit acellular module indicative of adaptive immune activation
为了确定可能驱动患者多样性的细胞表型之间的联系，我们在肿瘤中关联了谱系标准化的细胞类型频率(图5A)，揭示了t活化、IgG+浆细胞和MoMF-II之间的高度相关性;因此，我们将这一组统称为肺癌激活模块(LCAMhi)。根据这些细胞类型的几何平均分数对患者进行分类，表明患者在这方面分层良好(图5B-5D)。我们将这种分层的极端情况分别称为LCAMhi和LCAMlo患者。
为了确定可能有助于LCAM细胞组织形成的细胞间信号失调的肿瘤特异性模式，我们进行了进一步的分析，比较了LCAM组之间以及各组和各自nLung组织之间配体受体(LR)强度评分的差异(Martin et al, 2019)(表S6)。总体而言，与nLung相比，两个LCAM组在肿瘤中均表现出相关的LR激活(图5H)。特别是，它们在T细胞CXCL13和B细胞CXCR5之间表现出很强的强度评分(图5I)。总的来说，LCAMhi和LCAMlo患者之间LR强度的差异支持了LCAM患者的分层，并提供了免疫细胞串扰可能是LCAM轴发育的基础。
R7Projection of bulktranscriptomic data onto scRNA-derived signatures reveals the LCAMhi module in independentdatasets
R8LCAM immune response correlateswith tumor genotype and expression of tumor antigens
为了找出集合LCAM评分是否与特定基质群体相关，我们导出了针对8名NSCLC患者的公共数据集中确定的个体群体的特定基因列表(Lambrechts et al .， 2018;表S5)，并使用这些列表量化TCGA LUAD数据中的富集程度。整体LCAM评分与癌症相关成纤维细胞(CAF)评分相关，与正常成纤维细胞评分反相关，并与这些评分的差异强相关(图6B、S6G和S6H)。这些数据表明，LCAM细胞模块与CAF之间存在联系，由于CAF调节肿瘤浸润淋巴细胞功能，因此应进一步详细探讨这一联系(Salmon et al, 2012,
2019)。TMB是检查点反应最可靠的预测因子之一(Samstein等人，2019)，同时与整体LCAM评分相关(图6C;。
我们观察到不同分期的肿瘤中存在不同的LCAM(图S6J)。我们还观察到整体LCAM评分与CD274表达之间存在弱相关性(r = 0.14, p = 2.5 3
10?3)。总的来说，在我们的scRNAseq队列中，将大量特征投射到由变异定义的轴上表明，LCAM细胞模块的表达是对突变和异位表达的肿瘤抗原的适应性反应的标志，不依赖于总免疫浸润。
R9LCAM correlates withTP53 mutation and response to PD-L1 blockade
与TP53WT/(EGFR或KRAS或STK11)mut肿瘤相比，TP53mut肿瘤具有更高的整体LCAM评分(图7A和S7A)， TP53mut也与TMB升高相关(图7B和S7B)。为了控制TMB，我们将LCAM评分回归到LogTMB，并询问是否有任何驱动突变与残差相关，结果显示TP53mut患者的LCAM评分高于预期(图7C;p = 4.0 3 10?4)，而KRASmut患者的LCAM评分低于预期(图7D;P = 2.7 3 10?3)。
对所有TCGA肿瘤类型的类似分析显示，LCAM评分与多种癌症类型的TMB相关，尤其是乳腺癌、胃癌和膀胱癌(图7F)。
Cox比例风险回归显示，在接受atezolizumab的患者的单因素和多因素分析中，LCAM和TMB都倾向于改善无进展生存期(PFS)(图S7F，左面板)。[if !vml]
我们引入了预先选择的临床动机阈值，将患者分为LCAMhi(前25%)或LCAMlo, TMBhi(前50%)和TMBlo (STAR方法)。阿特唑单抗治疗患者的LCAMhi状态有改善OS的趋势(HR 0.62[0.36, 1.09])，而多西他赛治疗患者则没有(HR = 0.99[0.60, 1.64]，图S7G)。
个人总结：作者用未治疗NSCLC患者的tumor和部分配对的normal lung组织进行scRNA-seq，CITE-seq，TCR-seq，通过分析得到肺癌激活模块：LCAM，可以分为LCAMhigh和LCAMlow，LCAM和TMB相关，和PD1免疫治疗相关。
（大数据分析免疫细胞浸润情况，根据不同免疫细胞浸润的差异将多个免疫细胞的浸润模块化，对模块进行分析并赋予意义。）
