氨基己糖生物合成途径(HBP)、O-GlcNAc信号
磷酸戊糖途径(PPP)
线粒体抗病毒信号蛋白（MAVS）
线粒体钙单向转运体(MCU)
定量质谱quantitative mass spectrometry assay：
IL-2 signaling：T细胞激活过程中的增殖、功能作用[effector、memory T都需要]；调控effector-memory反应；Treg的产生与维持。但是在naive CD8+T的priming中不怎么关键
IL-2Rα含有2个sushi domains (SD)，为与IL-2结合所必需
SUSD2：单次I型跨膜蛋白，C端有SD结构域。胞质段很短，可能不能直接产生下游信号。该文尝试验证SUSD2是否通过与CD8+T膜表面其他蛋白相互作用从而调节CD8+T功能。
SD结构域以β-三明治结构为基础，介导蛋白-蛋白相互作用。许多human cancers中都报告了SUSD2的表达：乳腺癌、卵巢癌、NSCLC、胃癌、结直肠癌。肿瘤细胞上SUSD2的表达与肿瘤生长的关系（正相关或负相关）与肿瘤类型有关
1.Antitumor immune responses are improved in Susd2−/− mice
小鼠荷瘤：
对象——8-10周龄雄鼠、雌鼠；位置——皮下；细胞数——1x10^6
流式：
消化肿瘤——将肿瘤剪碎后使用1mg/ml IV型胶原酶+50U/ml DNase I，37℃，30min
过滤——70um滤网，制成单细胞悬液
染色
*p-STAT5胞内染色：
固定细胞——2%多聚甲醛paraformaldehyde，室温，10min
打孔——预冷的甲醇methanol，4℃，20min
洗3次——PBS+2%FBS+1mM EDTA
染色
*肿瘤浸润淋巴细胞的胞内细胞因子染色【IFN-γ、Gzmb、TNF、IL-2】
细胞体外刺激+蛋白转运抑制剂——50ng/ml 佛波酯PMA{PKC激活剂}+500ng/ml 离子霉素+【2种蛋白转运抑制剂】GolgiStop(莫奈霉素){作用于蛋白在内质网的累积阶段}+GolgiPlug(BFA){作用于蛋白在高尔基体的累积阶段}
如前所述一样染表面
固定、打孔——使用BD Cytofix/Cytoperm(BD Biosciences)
染胞内
*染核内【Foxp3、TCF-1】
如前所述一样染表面
固定、打孔——使用Foxp3 Fix/Perm Buffer Kit
染核内
*细胞凋亡分析
重悬细胞——使用annexin-V Binding Buffer
染凋亡——annexin-V与7-AAD viability solution，25℃，15min
annexin-V染凋亡的原理：annexin-V为Ca2+依赖性磷脂结合蛋白，能与磷脂酰丝氨酸（PS）高亲和力特异性结合。在细胞凋亡早期，只分布在正常细胞膜脂质双层内侧的磷脂酰丝氨酸（PS）翻向外侧，用标记了荧光素的Annexin V作为荧光探针，并搭配PI、7-AAD、DAPI等核酸染料使用，能够准确区分正常细胞、凋亡早期和凋亡晚期细胞。
死活染料：PI、DAPI、7-AAD，与细胞内部DNA结合。活细胞因为细胞膜具有选择透过性所以不会染上荧光。但如果做胞内或者核内染色实验，细胞已经经历了固定破膜的步骤，这种染料就不再适用了。所以这时候就需要使用另一种染料——新型的氨基结合染料（FVS系列荧光染料）
多维流式Multi-dimensionalflow cytometry assay
光谱流式Spectralflow cytometry analysis：传统流式使用补偿来调节荧光溢出，而全光谱流式通过光谱解析来区别出每个荧光染料。光谱解析是通过数学算法，根据荧光染料的独特光谱特征，区分出多色样本中的单色荧光。
抗体清除CD8+T：
对照组：IgG，200ug实验组：CD8 Ab，200ugAtD0、7、14未说明注射方式（腹腔注射❓）
给PD-L1 Ab/PD-1 Ab：
腹腔内注射，250ug，D7、10、13
2.Susd2−/− CD8+ T cells show enhanced antitumor function
RT-qPCR:
RNA提取——使用Trizol试剂
逆转录合成cDNA——使用Moloney murine leukemia virus reverse transcriptase，38℃，60min
qPCR——使用iTaq Universal SYBR Green Supermix in CFX Connect Real-Time PCR Detection System
IP+IB:
①IP提取蛋白样品:
裂解细胞——RIPA buffer+Protease Inhibitor Cocktail
孵育蛋白提取物——goat anti-V5 agarose或anti-Flag M2 Affinity Gel，4℃，于轻柔搅拌下过夜
洗5次——cold RIPA buffer
将蛋白从beads上洗脱——样本与30ul SDS sample buffer共孵育，95℃，10min
蛋白样品即存在于上清中
②IB分析提取的蛋白样品：
蛋白电泳——使用NuPAGE系统，根据说明书进行操作
FACS-based CD8+T体外杀伤细胞毒性实验：
给MC38，EG7，B16-OVA打上CFSE标签
用OVA257-264 pulse MC38 tumor cells——at 1 ug/ml，1h
体外活化的OT-1 T与 OVA257-264-pulsed tumors cells共孵育——不同比例，4h
用7-AAD进行死活染色，跑流式
体外抗原递呈：
BMDC与OVA257-264共孵育——1ug/ml OVA257-264，37℃，2h。用PBS洗3次
脾脏OT-1 T细胞分选——磁珠分选
OT-1 T与BMDC共孵育——比例5：1，96孔板
体外Treg-Naïve CD4+T 增殖抑制实验：
naive CD4+T刺激——1x10^5 CFSE-labeled naive CD4+CD25-细胞，用1ug/ml anti-CD3 Ab+1ug/ml anti-CD28 Ab刺激
Treg分选——磁珠分选
Treg与CD4+T共孵育——at different ratios【保留一个只有CD4+T的阳性对照】
3天后流式
T细胞过继转移实验：
prime Thy1.2+ OT-1 T with OVA257-264 for 3 days
Thy1.1+ WT鼠荷EG7(1x10^6 cells, 皮下)，7天后尾静脉注射Thy1.2+ OT-1 T(4x10^6 cells)
3.SUSD2-IL-2Rα interaction requires SD
逆转录病毒转导（SUSD2）实验：
用逆转录病毒向SUSD2-/- OT-1 T转导V5-tagged Susd2或empty vector（对照）
进行V5 agarose immunoprecipitation+LC-MS/MS[液相色谱-串联质谱]
步骤：
OT-1 T被置于6孔板中，用1ug/ml OVA257-264刺激24h
加入病毒所在的上清液（1：1vol/vol ratio）+8ug/ml 凝聚胺polybrene
32℃，2h，at 800×g。
2h后更换media，再用OVA257-264培养OT-1 T 48h
4.SUSD2 negatively regulates IL-2R signaling
IL-2-induced STAT5 activation has been shown to be important for increasing the suppressive activity of Treg cells
IL-2 binding assay：
1×10^6 OT-1 T细胞与biotinylated IL-2共孵育，100ul PBS+0.1% BSA，20min，4℃
PBS洗3次，使用steptavidin-PE染色，30min，4℃
（同时也要做一份平行对照，OT-1 T与未标记的IL-2共孵育）
流式
6.Deletion of Susd2 improves antitumor efficacy of CAR T cells
Cas9 nucleoprotein (RNP) complex electroporation：
Boyman O, Kovar M, Rubinstein MP, Surh CD & Sprent J Selective stimulation of T cell subsets with antibody-cytokine immune complexes. Science 311, 1924–1927 (2006). [PubMed:16484453]
Krieg C, Letourneau S, Pantaleo G & Boyman O Improved IL-2 immunotherapy by selective stimulation of IL-2 receptors on lymphocytes and endothelial cells. Proc Natl Acad Sci U S A 107,11906–11911 (2010). [PubMed: 20547866]
Spangler JB, et al. Antibodies to Interleukin-2 Elicit Selective T Cell Subset Potentiation through Distinct Conformational Mechanisms. Immunity 42, 815–825 (2015). [PubMed: 25992858]
Chen J, et al. NR4A transcription factors limit CAR T cell function in solid tumours. Nature 567, 530–534 (2019). [PubMed: 30814732]
