最近又看了一篇miRNA调控R基因的文章，2012年发表在PNAS上，挺有意思。
起源于N基因的22nt miRNA介导N基因的切割，并可产生次级siRNA，负调控植物的抗病性。
原来病原菌有时会沉默宿主sRNA的合成，导致植物体内miRNA无法正常合成。这时，R蛋白就会累积，从而增加抗病性。这真是植物和病原菌在慢慢历史长河中共同进化的杰作！
1.背景介绍
植物的两层免疫系统
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PTI
- PRRs识别PAMPs
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ETI
- R蛋白识别effectors
R基因
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分类
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NB-LRRs
- TIR-NB-LRR
- CC-NB-LRR
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RLPs(receptor-like proteins)
- 有一个跨膜结构域
- 一个胞外LRR结构域
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大部分有活性的R基因在基因组上串联重复
small RNA
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功能
- 介导基因沉默
- 影响基因组的完整性
- 基因调控
- 病毒免疫
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miRNA
- 前体RNA折叠形成发夹结构
- DCL1切割前体形成21或22nt的成熟miRNA
- 22nt的miRNA可在RDR6和DCL4的帮助下，切割target mRNA形成tasiRNA
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tasiRNAs
- 全称：transacting siRNAs，又叫secondary small interfering RNAs
- 从miRNA切割位点开始，in register或in phase分布
- 一般长度为21nt
- 可以沉默多个下游target
2.N基因是miRNA的target
在前期研究中，从烟草sRNA library中鉴定到了一个21nt的sRNA和N基因互补
用这个21nt的sRNA在烟草sRNA库中搜索，找到了一个和其互补的22nt sRNA
该22nt sRNA和N基因第一个外显子的125-146bp互补，这段序列是烟草N基因家族保守序列
为了找这点22nt sRNA的起源，以22nt序列为模板，在烟草基因组中找到了2个可能的前体
对这两个候选前体转录本进行二级结构预测，发现可形成颈环结构，并产生22nt miRNA
另外，还可形成一个21nt miRNA，target在22nt miRNA前面
使用5‘RACE和3’RACE进一步确认22nt和21nt sRNA前体的产生
使用5‘RACE确认miRNA介导对N基因及其homolog的切割
构建N-CFP(WT)和N-CFP(Mut)转基因株系，检测突变前能被切割，突变后不能
进一步通过5‘RACE产物测序确认切割位点
3.N基因产生的21nt siRNA和miR6019切割位点呈相位分布
除了上述miRNA，还鉴定到一些sRNA起源于N基因
这些siRNA大部分为21nt
一些sRNA mapping到N基因外显子上，一些在5’UTR上
sRNA富集的区域位于miR6019切割位点的下游
sRNA富集区域从切割位点开始呈现3和9 21nt register[3′D3(+) and 3′D9(+)]
在RDR6突变体中21nt sRNA的表达量降低
- 21nt sRNA的形成依赖于RDR6
在DCL24突变体中21nt sRNA的表达量也降低
- 21nt sRNA的形成依赖于DCL24
4.miR6019介导的切割是siRNA形成必需的
根据前面实验结果推测
- 22nt miR6019切割会诱导次级siRNA的形成
- N-CFP（WT）也可被切割形成siRNA
- N-CFP（Mut）不能被切割形成siRNA
- 当把N-CFP(WT)中的错配修复后，会促进切割形成更多的siRNA
将35S-miR6019,6020和N-CFP(WT)，N-CFP(Mut)在烟草叶片中共表达
通过电泳和测序检测共侵染叶片中的切割产物
Northern blot以及siRNA定量结果现实，修复miR6019和target之间的错配后，起源于CFP的siRNA增多
5.过表达siR6019和siR6020降低N基因介导了TMV抗性
将miR6019,6020,N基因，TMV-GFP在烟草叶片中过表达
miR6019,6020,N基因，TMV-GFP共表达的烟草叶片中病毒扩散更快（荧光多），且没有过敏反应
6.22nt miRNA靶向R基因产生siRNA
检测miRNA对R基因调控是否具有普遍性？
通过生物信息学手段预测出10个siRNA家族可能分别调控10个R基因家族
通过实验验证一些miRNA确实可以切割R基因，并产生siRNA
一些22nt siRNA target到R基因NB-ARC domain保守的P-loop序列，切割并产生次级siRNA
